北五味子多糖對高脂血癥大鼠肝損傷的影響

吳金瀅 趙允龍 李 賀 高曉旭 陳建光 王春梅

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

脂質(zhì)代謝紊亂是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病的關(guān)鍵因素〔1，2〕。尋找降脂保肝的新藥具有非常重要的意義。北五味子、具有斂肺滋陰、生津止瀉、寧心安神等功效，被列入國家藥典和保健食品可用原料的名單，但到目前為止均以復(fù)方制劑入藥，以單味藥入藥還沒有得到很好的開發(fā)和應(yīng)用〔3〕。五味子含有多糖、木脂素等活性成分〔4〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明五味子多糖(SCP)具有提高免疫力、保護肝臟、調(diào)節(jié)血脂代謝、降低血糖、減肥、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等作用〔5～8〕。對五味子及其有效成分在保護肝臟的研究中，僅見有防治化學(xué)性及酒精性肝損傷等作用進行研究，但其對高脂血癥引起的NAFLD是否具有防治作用。尚未見報道。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)肝損傷大鼠模型，觀察SCP對高脂血癥引起的NAFLD的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及飼料 健康清潔級雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供(許可證編號：2008-0005)。普通飼料成分及其熱量：脂肪5%，碳水化合物53%，蛋白質(zhì)23%，包括纖維素及水分在內(nèi)的其他成分占19%，總熱量為25 kJ/kg；高脂飼料成分及其熱量：膽固醇2%，膽酸鈉0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，脂肪22%，碳水化合物48%，蛋白質(zhì)20%，包括纖維素及水分在內(nèi)的其他成分占7.3%，總熱量為48.3 kJ/kg。大鼠采取分籠飼養(yǎng)，并維持12 h∶12 h晝夜循環(huán)，每日喂食，自由采食、飲水。

1.1.2藥品與試劑 SCP由北華大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)與工程實驗室優(yōu)選新品種，首先通過超臨界CO2流體萃取，將北五味子中水溶性成分和脂溶性成分分離，然后利用超聲波產(chǎn)生的強烈震動、高加速度、強烈空化效應(yīng)及攪拌作用，經(jīng)超聲波預(yù)處理40 min進行浸提，再經(jīng)酶法與三氯乙酸結(jié)合脫蛋白得SCP，提取率為77.6%，純度可達50%〔9,10〕；膽固醇(批號201110)，膽酸鈉(批號201111)，氨基甲酸乙酯(批號T20101026)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號110607-1)，甘油三酯(TG)試劑盒(批號20111031)，總膽固醇(TC)試劑盒(批號20111102)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號20120410)，谷草轉(zhuǎn)氨酶試(AST)劑盒(批號20120412)。

1.1.3儀器 Infinite M200TECAN酶標(biāo)儀，瑞士TECAN集團公司；JY92-IID超聲波細胞粉碎儀/粉碎機，寧波新生生物科技股份有限公司；ESJ110-4B電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；MH-2微量振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ飛鴿牌離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；RM2126石蠟切片機，德國Leica公司；OLympus Bx50光學(xué)顯微鏡，日本OLympus公司。

1.2方法

1.2.1高脂血癥大鼠模型的建立及分組 32只Wistar雄性大鼠，隨機分出正常對照組和正常SCP干預(yù)組各8只，以普通飼料喂養(yǎng)，其余16只用于建立高脂血癥大鼠模型，高脂飼料喂養(yǎng)。4 w后，禁食12 h，大鼠尾靜脈采血，檢測TC和TG。確定高脂血癥模型成功。將制備成功的高脂血癥大鼠16只隨機分為高脂血癥模型組和SCP治療組各8只。藥物處理組每日以SCP 50 mg/kg，連續(xù)灌胃12 w，正常對照組和模型組給予等體積溶媒灌胃12 w。

1.2.2血脂和血清轉(zhuǎn)氨酶檢測 治療結(jié)束后，大鼠禁食12～16 h，烏拉坦(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血并處死動物。大鼠約取血4～5 ml/只，分離血清，分裝入EP管，-70℃凍存待測。TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ALT及AST采用酶學(xué)方法檢測，具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.3肝脂質(zhì)檢測 提取肝臟脂質(zhì)，取200 mg肝組織，放入冰冷的生理鹽水中漂洗，去除殘留血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱重，并迅速用手術(shù)刀片切碎，置于離心管中，按氯仿/甲醇=2∶1(V/V)混合，先加入3倍體積的甲醇，13 000 r/min電動勻漿10 s/次，間隔30 s，連續(xù)3～5次，在冰水中進行，再加入6倍體積的氯仿，漩渦混合器上混勻，制備成10%的肝組織勻漿。將勻漿液置恒溫振蕩器中不斷振蕩抽提24 h后，小心抽取下相脂質(zhì)層10 μl。采用酶學(xué)方法檢測肝臟組織中TC和TG，具體操作方法嚴格按照試劑盒說明書。

1.2.4肝臟病理學(xué)檢測 大鼠取血后，小心分離肝臟與周圍組織，在相同部位取肝左葉組織塊，冷生理鹽水沖洗后，置入10%甲醛溶液固定后，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡過夜，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，行蘇木素-伊紅(HE)染色，再進行梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來。最后滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血脂的比較 與正常對照組比較，模型組血清中TC、TG和LDL-C水平顯著增高(P<0.01)，HDL-C水平無明顯變化。SCP治療12 w，顯著降低了模型組血清TC、TG和LDL-C水平(P<0.05)，而對正常大鼠血脂沒有明顯影響。見表1。

表1 各組大鼠血脂的比較

2.2各組大鼠肝脂質(zhì)的比較 與正常對照組比較，模型組肝組織中TC和TG水平顯著增高(P< 0.01)。SCP治療12 w，顯著降低了模型組肝組織中TC和TG水平(P< 0.01)，而對正常大鼠肝脂質(zhì)脂沒有明顯影響。見表2。

2.3各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的比較 與正常對照組比較，模型組血清中ALT和AST水平顯著增高(P< 0.01)，SCP治療12 w，顯著降低了模型組血清ALT和AST水平(P< 0.05)，而對正常大鼠肝功能沒有明顯影響。見表2。

表2 各組大鼠肝臟脂質(zhì)及血清轉(zhuǎn)氨酶的比較

2.4各組大鼠肝病理學(xué)的比較 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞形態(tài)呈圓形，核位于中央，胞漿染色均勻呈粉色，小葉周邊匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，小葉中央靜脈擴張，小葉內(nèi)可見肝細胞脂肪變性，出現(xiàn)以大泡性脂肪變性為主的混合性脂肪變性，肝細胞體積增大，胞漿內(nèi)可見脂肪空泡，小葉內(nèi)可見肝細胞點狀壞死；SCP治療組與模型組相比肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小葉內(nèi)肝細胞脂肪變性明顯減輕，偶可見肝細胞點狀壞死。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)的比較(HE染色,×100)

3 討 論

近年來植物多糖以其優(yōu)良的調(diào)節(jié)血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等功效而備受關(guān)注。五味子是我國傳統(tǒng)保肝藥，多與其他藥物合用臨床用于防治化學(xué)性及酒精性肝損傷〔11〕。依據(jù)“二次打擊學(xué)說”，“初次打擊”是指過多的脂肪在肝臟的堆積，而脂肪沉積于肝細胞其最主要的機制為進入肝細胞的脂肪酸(FFA)過多。肝臟線粒體氧化途徑不能滿足FFA的代謝，過量的FFA轉(zhuǎn)化為TG儲存于肝細胞質(zhì)中，導(dǎo)致肝內(nèi)TG的堆積。當(dāng)肝細胞內(nèi)TG合成的速度過快,肝內(nèi)合成的極低密度脂蛋白(VLDL)不能運出肝臟清除時，則肝內(nèi)TG蓄積達到一定程度，就會形成脂肪肝〔12〕。有研究〔13〕表明，高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠血清和肝臟脂質(zhì)的含量會同步增高。本實驗研究結(jié)果與之相符，并說明SCP對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血脂及肝脂質(zhì)代謝紊亂具有良好的改善作用。

血脂升高，肝中脂肪來源過多，肝功能障礙，肝合成釋放脂蛋白的功能降低及氧化脂肪酸的能力減弱；合成磷脂原料減少則影響脂蛋白的形成和輸出，從而發(fā)生肝功能異常。ALT和AST均為非特異性細胞內(nèi)功能酶，當(dāng)肝細胞壞死、細胞膜損傷時，由于肝細胞膜通透性增高，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶血液外漏，使血清ALT和AST活性增高，因此能敏感地反映肝細胞損傷與否及損傷的程度〔14〕。本研究結(jié)果顯示，SCP治療有很好的保護肝功能、逆轉(zhuǎn)肝功能異常的作用。此外，也說明SCP治療在改善大鼠肝功能的同時也明顯減輕了高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性。

綜上,SCP表現(xiàn)出良好的降脂保肝作用,將為SCP防治NAFLD提供理論依據(jù)。

4 參考文獻

1Tarantino G,Saldalamacchia G,Conca P,etal. Non-alcoholic fatty liver disease:further expression of the metabolic syndrome 〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2007;22(3):293-303.

2Kotronen A,Yki-Jarvinen H. Fatty liver：a novel component of the metabolic syndrome 〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008;28(1):27-38.

3國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)〔M〕. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

4史 琳,王志成,馮敘橋. 五味子化學(xué)成分及藥理作用的研究進展〔J〕. 藥物評價研究,2011;34(3):208-12.

5孫文娟,呂文偉,于曉鳳,等. 北五味子粗多糖抗衰老作用的實驗研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2001;21(6):454-5.

6李明珠,王艷杰,徐 放. 五味子粗多糖抑制腫瘤和抗突變作用的實驗研究〔J〕. 黑龍江中醫(yī)藥,2007;36(3):40-1.

7李 巖,張明淑,曲紹春,等. 北五味子粗多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的保護作用〔J〕.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1995;21(6):583-5.

8高曉旭,孟憲軍,李繼海. 北五味子活性多糖降脂減肥作用的研究〔J〕.食品工業(yè)科技,2008;29(11):248-51.

9高曉旭,孟憲軍,李繼海,等. 北五味子多糖超聲波提取條件的優(yōu)化〔J〕. 食品研究與開發(fā),2008;29(9):27-30.

10孟憲軍,秦 琴,高曉旭. 北五味子多糖的分離純化及清除自由基研究〔J〕. 食品科學(xué)，2008;29(1):91-4.

11趙輝平,李 峰,王勝春,等. 柴胡、丹參和五味子配伍對CCl4所致肝硬化大鼠的作用及其機制〔J〕. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2005;14(6):610-4.

12Day CP. NASH-related liver failure:one hit too many 〔J〕. Am J Gastroenterol,2002;97(8):1872-4.

13王志平. 大鼠高脂飲食性脂肪肝模型血漿和肝臟脂質(zhì)含量變化〔J〕. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001;32(2):131-2.

14李 瑜. 非酒精性脂肪肝病的研究進展〔J〕. 世界華人消化雜志,2013;21(2):109-15.