人參皂甙對(duì)氯胺酮麻醉后老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

鄧 昌 歐陽(yáng)波 陶 然 余順治 金 華

(昆明市官渡區(qū)人民醫(yī)院急診科，云南 昆明 650200)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)可導(dǎo)致患者喪失獨(dú)立生活的能力，給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。氯胺酮為N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體的非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，是一種臨床上常用的靜脈麻醉藥。研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮能損害大腦的神經(jīng)細(xì)胞，引發(fā)POCD的產(chǎn)生〔1，2〕。目前還沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的治療或預(yù)防POCD的方法。人參是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，其主要活性成分人參皂甙對(duì)老齡動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)具有良好的改善及保護(hù)作用。人參皂苷的成分如人參皂甙Rg1和Rb1能促進(jìn)膽堿能代謝，改善中樞膽堿能系統(tǒng)，增強(qiáng)動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力〔3〕。人參皂甙還能通過(guò)增加大腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙對(duì)電休克、腦缺血和睡眠剝奪等造成的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能受損均有顯著性地保護(hù)作用〔4～6〕。然而，人參皂甙對(duì)麻醉術(shù)后學(xué)習(xí)和記憶障礙的影響，目前報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，探討人參皂甙對(duì)氯胺酮麻醉后老年大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其可能的機(jī)制，為臨床防治POCD提供理論依據(jù)與參考。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 14月齡的清潔級(jí)健康SD大鼠48只，體重400～450 g,由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1 w，自由攝食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及儀器 鹽酸氯胺酮注射液(購(gòu)自福建古田藥業(yè)有限公司，批號(hào)：110301-2)；人參皂苷(購(gòu)自吉林省集安萬(wàn)泰中藥廠)；Morris水迷宮儀(由北京普升科技有限公司提供)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)檢測(cè)試劑盒(Rapidbio公司進(jìn)口分裝)。

1.3動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)分為四組，每組12只：對(duì)照組(A組)、氯胺酮組(B組)、人參皂甙低劑量組(C組)和人參皂甙高劑量組(D組)。A組：第1天(D0)腹腔注射生理鹽水，第2天(D1)至第6天(D5)無(wú)藥物處理。B組：第1天(D0)腹腔氯胺酮(80 mg/kg)，從第2天(D1)開(kāi)始每日腹腔注射生理鹽水，持續(xù)至D5。C組：第1天(D0)腹腔氯胺酮(80 mg/kg)，從第2天(D1)開(kāi)始每日腹腔注射人參皂甙(20 mg/kg)，持續(xù)至D5。D組：第1天(D0)腹腔氯胺酮(80 mg/kg)，從第2天(D1)開(kāi)始每日腹腔注射人參皂甙(100 mg/kg)，持續(xù)至D5。

1.4水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮由一個(gè)直徑130 cm、高50 cm的圓形水池及一個(gè)直徑為12 cm的圓柱形玻璃平臺(tái)構(gòu)成。池壁分為4個(gè)象限，標(biāo)有4個(gè)入水點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)前水池注入水至水平面高于平臺(tái)頂1 cm。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持環(huán)境的安靜，水溫控制在(23±2)℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照參考文獻(xiàn)進(jìn)行，分為兩部分：(1)定位航向?qū)嶒?yàn)，D0于麻醉前讓大鼠自由游泳2 min，熟悉迷宮環(huán)境。從D1起，每天注射藥物2 h后，對(duì)大鼠進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練間隔60 s。從4個(gè)不同入水點(diǎn)將大鼠面向池壁分別放入水中，記錄大鼠爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(即逃避潛伏期)，找到平臺(tái)后，讓大鼠停留于平臺(tái)上10 s。如果在2 min內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)，則人為地將其引至平臺(tái)上停留10 s，此時(shí)潛伏期記為120 s。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：在D5最后一次訓(xùn)練后，撤除平臺(tái)，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測(cè)量大鼠在120 s內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.5海馬區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的檢測(cè) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭開(kāi)顱取腦，將海馬組織用4℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液,用于NGF和BDNF含量的檢測(cè)。NGF和BDNF的檢測(cè)采用ELISA法。操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的要求進(jìn)行。

1.6海馬區(qū)p-ERK和p-CREB表達(dá)水平的檢測(cè) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭開(kāi)顱取腦，分離海馬組織，放入玻璃研磨器中磨碎為分散的細(xì)胞。加入0.5 ml的細(xì)胞裂解液(0.1 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L Tris-HCl pH 7.6，1 mmol/L EDTA pH 8.0，1 μg/ml Aprotinin，100 μg/ml PMSF)冰上裂解45 min,15 000 r/min離心15 min,取上清液，-80℃保存，用蛋白免疫印記法檢測(cè)p-ERK和p-CREB的表達(dá)水平。具體過(guò)程如下：BCA法行蛋白定量分析。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜中。用15 ml含有5%牛血清白蛋白的TTBS緩沖溶液4℃封閉過(guò)夜。然后分別加入ERK (1∶1 000)、 p-ERK(1∶500)、CREB (1∶1 000)和p-Ser133-CREB(1∶500)的一抗封閉1 h。TTBS洗膜3次，每次5 min，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG抗體，于室溫輕搖1 h雜交反應(yīng)，TTBS洗膜6次，每次5 min。加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)5 min后保鮮膜包裹，暗室內(nèi)進(jìn)行X線膠片曝光、顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1定位航向?qū)嶒?yàn)結(jié)果 經(jīng)過(guò)5 d的隱匿平臺(tái)訓(xùn)練，各組逃避潛伏期呈逐漸縮短的趨勢(shì)。D1和D2時(shí)各組間均無(wú)顯著差異；D3～D5，與A組相比，B組尋找平臺(tái)的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；與B組相比，C組的逃避潛伏期于D4時(shí)縮短明顯，而D組的逃避潛伏期于D3時(shí)已開(kāi)始顯著縮短。見(jiàn)表1。

2.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 氯胺酮麻醉后各組大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)與A組(6.8±0.5)相比均有所減少，其中B組(3.8±0.4)差異顯著(P<0.05)。C組(4.2±0.6)和D組(5.9±0.5)大鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)均明顯比B組增加(P<0.05)。

2.3各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水平的變化 與A組相比，B組大鼠海馬勻漿中NGF和BDNF的含量下降(P<0.01)；與B組比較，C組和D組NGF和BDNF的含量均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期的變化

表2 各組大鼠海馬區(qū)NGF和BDNF的表達(dá)變化

2.4各組大鼠海馬CREB、p-Ser133-CREB的表達(dá)變化 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與A組相比，B組大鼠海馬總CERB蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異，B組海馬p-Ser133-CREB的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與B組比較，C組和D組海馬p-Ser133-CREB的蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.5各組大鼠海馬ERK、p-ERK的表達(dá)變化 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與A組相比，B組大鼠海馬總ERK蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異，B組海馬p-ERK的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與B組比較，C組和D組海馬p-ERK的蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 人參皂甙對(duì)海馬區(qū)CREB活性的影響

圖2 人參皂甙對(duì)海馬區(qū)ERK活性的影響

3 討 論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類對(duì)神經(jīng)組織起著特殊營(yíng)養(yǎng)作用的小分子多肽因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化和存活，并可調(diào)節(jié)突觸的可塑性，其中以NGF和BDNF最為重要。NGF通過(guò)與特異性的TrkA受體結(jié)合，激活細(xì)胞代謝，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)中樞和周圍神經(jīng)細(xì)胞的存活和軸突的生長(zhǎng)， 并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)起著十分重要的作用。而B(niǎo)DNF通過(guò)與其特異性的高親和力受體TrkB結(jié)合而發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。隨著研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在改善認(rèn)知功能方面具有十分重要的作用〔7，8〕。NGF和BDNF可以改善老年癡呆模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)〔9〕。研究證實(shí)，氯胺酮會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙〔10〕。本研究顯示氯胺酮所致的認(rèn)知功能障礙與其引起的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子減少有關(guān)。人參皂甙可通過(guò)增加NGF和BDNF的水平改善氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙：①在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF和BDNF具有維持神經(jīng)細(xì)胞生存的作用；而在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的情況下其具有神經(jīng)保護(hù)與修復(fù)的功能。研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔11～13〕。因此，人參皂甙可能通過(guò)維持NGF和BDNF表達(dá)水平，以維持神經(jīng)細(xì)胞的存活，抑制細(xì)胞凋亡，從而改善氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。②乙酰膽堿是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要遞質(zhì)，參與注意力、記憶和睡眠等過(guò)程〔14，15〕。擬膽堿能藥物或海馬區(qū)內(nèi)移植膽堿能胚胎組織均可改善學(xué)習(xí)記憶功能。NGF的缺失會(huì)導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元發(fā)生皺縮，減少膽堿能神經(jīng)元的纖維密度，降低乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿的含量〔16〕。NGF和BDNF表達(dá)水平的增加能夠促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿的合成，并對(duì)膽堿能神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)作用，改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙可以阻止氯胺酮所致NGF和BDNF表達(dá)水平的減少。因此，人參皂甙可能通過(guò)維持NGF和BDNF表達(dá)水平，以維持膽堿能神經(jīng)元的活性，并增加乙酰膽堿的含量，從而改善氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。

cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能〔17〕。當(dāng)CREB的第133位絲氨酸發(fā)生磷酸化時(shí)，磷酸化的CREB即成為活性狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中具有cAMP應(yīng)答元件的基因轉(zhuǎn)錄。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CREB參與突觸可塑性和長(zhǎng)時(shí)程記憶的形成過(guò)程。CREB表達(dá)量或活性的下降會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙，而CREB的高表達(dá)可改善學(xué)習(xí)記憶功能。研究發(fā)現(xiàn)，許多與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因都受到CREB的調(diào)控，如神經(jīng)遞質(zhì)受體亞基GluR1、BDNF和即早基因等。CREB的活性受到多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，如cAMP-PKA通路、有絲分裂原激活的蛋白激酶通路、鈣離子-鈣調(diào)蛋白激酶通路和應(yīng)激相關(guān)的P38通路。已有研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙與其對(duì)ERK和CREB活性的抑制有關(guān)〔18，19〕。而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可降低老年大鼠海馬區(qū)內(nèi)p-ERK和p-CREB的表達(dá)水平；而人參皂甙可以阻止氯胺酮對(duì)p-ERK和p-CREB的抑制作用。因此，人參皂甙可能通過(guò)增加NGF和BDNF表達(dá)水平，激活ERK-CREB信號(hào)通路，以增加學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因(如NGF、BDNF、c-fos等)的表達(dá)，從而改善氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。

人參皂甙是人參的主要活性成分，具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化作用、抗凋亡作用、抗興奮性毒害和鈣通道拮抗作用等。近年研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，能夠增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶，抵抗衰老。學(xué)習(xí)和記憶是一個(gè)十分復(fù)雜的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程，需要神經(jīng)遞質(zhì)、信號(hào)分子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和基因表達(dá)的協(xié)同作用。人參皂甙能增加基底前腦乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶及海馬區(qū)內(nèi)NGF和BDNF的表達(dá)〔20，21〕。在NGF缺失下，人參皂甙可以促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)〔22〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參皂甙對(duì)氯胺酮麻醉后老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，與其恢復(fù)氯胺酮導(dǎo)致海馬區(qū)NGF和BDNF的低表達(dá)及p-ERK和p-CREB的低活性有關(guān)。然而，人參皂甙是否還可以通過(guò)其他途徑(如抗氧化和抗凋亡等)改善氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制如何，還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，人參皂甙可用于POCD的防治。

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