激動(dòng)乙醛脫氫酶2對抗離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷導(dǎo)致心律失常和氧化應(yīng)激作用

康品方 高 琴 葉紅偉 湯 陽 潘強(qiáng)強(qiáng) 何培寶 王洪巨

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的重要原因〔1〕。再灌注組織可通過黃嘌呤氧化系統(tǒng)，白細(xì)胞的“呼吸爆發(fā)”等途徑產(chǎn)生大量的氧自由基，攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用損傷膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔2〕。長期過量飲酒可導(dǎo)致高血壓、心律失常、腦中風(fēng)、肝硬化等〔3〕。而適量飲酒則對身體有益，可減少心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。乙醛脫氫酶2(ALDH2)是線粒體的重要醛類氧化酶，乙醇是ALDH2的非特異性激動(dòng)劑。前期研究證實(shí)，使用乙醇激動(dòng)ALDH2，可對抗糖尿病大鼠心肌I/R的損傷作用〔4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察增加ALDH2表達(dá)對大鼠I/R所致的心律失常、氧化應(yīng)激等心肌損傷的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。乙醇購自安徽省蚌埠市新科電化試劑廠，分析純，體積分?jǐn)?shù)≥0.997。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號：20110903)，購自南京建成生物技術(shù)研究所。ALDH2試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.2主要儀器 Langendorff灌流裝置，生物信號采集處理系統(tǒng)，MedLab-U/AC,南京美易科技有限公司；SC-15數(shù)控超級恒溫槽，寧波天恒儀器廠；FSH-Ⅱ型電動(dòng)勻漿器，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；Eppendorff 5810R冷凍高速離心機(jī)，德國；酶標(biāo)儀：澳大利亞。

1.3方法

1.3.1復(fù)制大鼠心肌I/R損傷模型 實(shí)驗(yàn)前12 h動(dòng)物禁食，自由飲水。水合氯醛(4 g/kg)腹腔麻醉后，開胸迅速取出心臟，置于4°C改良Krebs-Henseleit(K-H)液中，迅速轉(zhuǎn)移心臟、固定與Langendorff灌流裝置，K-H液常規(guī)恒壓(10.13 kPa)灌流。采用5-0號醫(yī)用無損傷縫合線穿過冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)30 min模擬局部心肌缺血，然后松開結(jié)扎線恢復(fù)灌流120 min。

1.3.2心律失常評分方法 根據(jù)1984年倫敦Lambeth會議確定的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)，采用心律失常評分法對心律失常嚴(yán)重程度進(jìn)行定量分析。具體評分辦法：0分：無心律失常；1分：房性心律失常或偶發(fā)室性早搏；2分：頻發(fā)室性早搏；3分：室性心動(dòng)過速(1～2陣)；4分：室性心動(dòng)過速(>3陣)或心室顫動(dòng)。

1.3.3灌流心臟流出液乳酸脫氫酶(LDH)的測定 復(fù)灌5和10 min收集冠脈流出液，分光光度計(jì)測定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。

1.3.4心肌組織SOD活性及MDA含量測定 心臟灌流結(jié)束后，迅速取下心臟，用冷的生理鹽水將心臟內(nèi)殘液洗凈，切除心房、右心室及血管、脂肪等非心肌組織，用濾紙吸干水分，置于-80℃冷凍保存。取100 mg心肌組織在冰上制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心15 min后取上清，分別按試劑盒說明書以酶標(biāo)儀測定心肌組織SOD活性及MDA含量。

1.3.5ALDH2活性測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取左室前壁心尖部組織100 mg，碾碎成粉末狀，加入預(yù)冷的100 μl裂解液充分混勻，冰槽孵育30 min后低溫離心10 min,取上清液行蛋白定量。

1.3.6實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分兩組(n=6)：①I/R組：相同年齡正常大鼠離體心臟平衡30 min后，局部心肌缺血30 min，復(fù)灌120 min作為單純I/R組；② 乙醇激動(dòng)劑I/R組(EtOH I/R)：大鼠予以2.5%乙醇日常飲用，1 w后乙醇調(diào)整至5%，持續(xù)8 w，后行I/R。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1乙醇對I/R心肌心律失常評分的影響 與I/R組相比，乙醇激動(dòng)劑I/R組在再灌注各時(shí)間段均可明顯降低大鼠心肌室性心律失常評分(P<0.01)。見表1。

2.2大鼠心肌I/R后LDH的變化 與大鼠I/R相比，乙醇激動(dòng)劑I/R組復(fù)灌5和10 min冠脈流出液LDH的含量降低〔(53.81±5.58)，(50.44±4.78)U/L vs 6(6.08±7.60)，(60.50±6.93)U/L，P<0.05)〕。

2.3乙醇對心肌I/R心肌生化指標(biāo)的影響 乙醇激動(dòng)劑I/R組心肌MDA含量顯著降低，SOD、ALDH2活性顯著顯著增加，與I/R組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 兩組大鼠各時(shí)期心律失常評分的比較

表2 乙醇對心肌組織I/R后SOD、ALDH2活性和MDA含量的影響

3 討 論

心肌I/R損傷時(shí)，心肌細(xì)胞膜通透性增加致使心肌酶漏出，其中以LDH含量最高；心電圖亦是評價(jià)心肌損傷的重要指標(biāo)，其變化在一定程度上可反映I/R損傷的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)提示長期應(yīng)用低濃度乙醇降低心律失常的發(fā)生，減輕I/R的損傷程度，對大鼠心肌具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌I/R后心肌損傷的重要原因〔1〕，MDA是氧自由基與細(xì)胞膜脂類成分發(fā)生氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物之一，MDA增加表明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，MDA含量可間接反映氧自由基對心肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度；SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的一種特異酶，其活性反應(yīng)機(jī)體抗氧化功能，SOD活性下降引發(fā)脂質(zhì)過氧化物在金屬離子存在下催化裂解產(chǎn)生MDA，誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔5〕。本實(shí)驗(yàn)提示乙醇可能通過對抗氧化應(yīng)激發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

ALDH2是體內(nèi)重要的醛類氧化酶，不僅是酒精代謝過程中的關(guān)鍵酶，而且是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)因子。ALDH2參與肝臟對乙醇的代謝，乙醇在乙醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，經(jīng)ALDH2的催化生成乙酸，同時(shí)，ALDH2可以加快4-羥壬烯醛(4-HNE)等醛類物質(zhì)的清除，減輕這類物質(zhì)對心肌的氧化損傷，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用〔5〕。ALDH2在抗心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)大鼠心臟中處于較高水平〔6〕。激活A(yù)LDH2活性，在離體I/R損傷模型中，可以使大鼠心肌梗死面積減少60%〔7〕。Chen等〔8〕證實(shí)急性給予10～50 mmol/L乙醇對長時(shí)間缺血引起的離體大鼠心肌有保護(hù)作用，且可能通過直接激活心肌的εPKC發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ALDH2的活性增加可能與降低心律失常發(fā)生、減輕心肌損傷有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1Filippo CD,Marfella R，Cuzzocrea S,etal.Hyperglycema in streptozotocin-induced diabetic rat increases infarct size associated with low levels of myocardial HO-1 during ischemia/reperfusion〔J〕.Diabetes，2005；54(3):803-10.

2Anderson EJ，Rodriguez E，Anderson CA，etal.Increased propensity for cell death diabetic human heart in mediated by mitochondrial-dependent pathway〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011；301(5):H118-24.

3Corovic N，Durakovic Z，Misgoj-Durakovicm.Dispersion of the corrected QT and JT interval in the electrocardiogran of alcoholic patients〔J〕.Alcohol Clin Exp Res，2006；30(1):150-4.

4王洪巨，康品方，葉紅偉，等.激動(dòng)乙醛脫氫酶2對抗糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷的作用〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012；28(2):133-6.

5Budas GR，Disatnik MH，Mochly-Rosen D.Aldehyde dehydrogenase 2 in cardiac protection：a new therapeutic target〔J〕?Trends Cardiovasc Med，2009；19(5):158-64.

6張 敏，朱 穎，胡 波，等.α-actinin-4與多柔比星腎病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系〔J〕.實(shí)用兒科臨床雜志，2009；24(5):358-60.

7Chen GH，Gray MO，Moch-Rosen D.Cardioprotection from ischemia by a brief exposure to physiological levels of ethanol：role of epsilon protein kinase C〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999；96(22)：12784-9.

8Chen CH，Budas GR，Churchill EN,etal.Activation of aldehyde dehydrogenase-2 reduces ischemic damage to the heart 〔J〕.Science，2008；321(5895)：1493-5.