人參二醇組皂苷改善內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠腎功能的機(jī)制

陳 燕 孟 艷 杜艷偉 于 淇 王曉琴 付 雙 劉蓮勤 方 圓 趙雪儉

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021)

膿毒血癥誘發(fā)的失控性全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)是導(dǎo)致多器官衰竭的重要原因，而急性腎損傷(AKI)是其中最嚴(yán)重的并發(fā)癥，致死率極高〔1～3〕。膿毒血癥發(fā)生時(shí)內(nèi)毒素(LPS)直接與內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞結(jié)合，刺激大量細(xì)胞因子及自由基的產(chǎn)生和釋放，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔4〕。此過(guò)程中，腎臟是受累的主要器官，氧化應(yīng)激在LPS誘導(dǎo)的AKI中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬探討人參二醇組皂苷(PDS)改善LPS誘導(dǎo)AKI小鼠腎功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)吉林大學(xué)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2藥物 PDS由吉林大學(xué)天然藥物研究室提供，專利號(hào)ZL 98 100070.3，使用時(shí)用生理鹽水配制。

1.2方法

1.2.1AKI小鼠模型的構(gòu)建 24只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為如下3組(n=8)：對(duì)照組、LPS組、PDS+LPS組。對(duì)照組經(jīng)腹腔注射0.5 ml 0.9%氯化鈉。LPS組、PDS+LPS組小鼠分別經(jīng)腹腔注射LPS 10 mg/kg (大腸桿菌血清型O111：B4，購(gòu)于英國(guó)Sigma公司)。PDS+LPS組小鼠在LPS注射前1 h經(jīng)腹腔注射PDS(25.0 mg/kg)。脂多糖注射12 h, 戊巴比妥將小鼠深度麻醉后, 取腎臟凍存或固定，備蛋白表達(dá)與形態(tài)學(xué)觀察用，并收集血液用于生化檢測(cè)。

1.2.2小鼠腎臟組織HE染色 給予PDS預(yù)保護(hù)1 h后注射LPS 12 h之后，將各組小鼠處死，并分離腎臟組織，通過(guò)HE染色的方法觀察各組腎臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒(DeadEndTM熒光測(cè)定系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Promega公司)說(shuō)明書操作，檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡情況，以腎臟組織出現(xiàn)棕褐色、且著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽(yáng)性。

1.2.4全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血液生化指標(biāo) 小鼠的血清樣品離心(3 000 r/min，10 min)，利用診斷試劑盒(均購(gòu)于南京建成生物科技公司)與全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)，Beckman Coulter LX20)檢測(cè)：腎功能標(biāo)志物〔肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)〕、肝功能標(biāo)志物〔谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)〕。

1.2.5Western印跡方法檢測(cè)蛋白表達(dá) 將50～100 mg的腎臟組織用液氮研磨成粉末并移至EP管中。將500～800 μl組織裂解液RIPA(含PMSF和蛋白酶抑制劑，購(gòu)于碧云天公司)加入盛有腎組織粉末的EP管內(nèi)，于冰上孵育10 min，室溫放置10 min，4℃，12 000 r/min，離心20 min。用微量移液器吸取上清后分裝，保存于-80℃。按照常規(guī)方法配制聚丙烯酰胺凝膠，依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL顯色。特異性條帶用上海天能科技有限公司GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。

1.2.6檢測(cè)腎組織中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性 腎組織NO含量檢測(cè)采用硝酸還原酶法測(cè)定，MDA含量檢測(cè)采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定，用SOD測(cè)定試劑盒檢測(cè)腎臟SOD活性；分別用分光光度計(jì)在550 nm、535 nm、550 nm處讀數(shù)(以上檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所)。

1.2.7檢測(cè)腎組織一氧化氮合成酶(iNOS)及Mn-SOD蛋白表達(dá) 應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)腎組織iNOS及Mn-SOD蛋白表達(dá)(抗體均購(gòu)于Abcam，Cambridge，MA，USA)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色顯示各組腎臟組織形態(tài)學(xué)變化 LPS組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管腔縮小、腎間質(zhì)水腫，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；PDS+LPS組與LPS組比較，上述表現(xiàn)明顯減輕。見圖1。

2.2各組小鼠腎臟組織凋亡情況 應(yīng)用TUNEL方法檢測(cè)可見腎臟組織細(xì)胞中有棕褐色深染顆粒，說(shuō)明有細(xì)胞凋亡。見圖2。并且LPS組凋亡程度嚴(yán)重，PDS+LPS組凋亡程度較LPS組減輕。

圖1 腎臟組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,×100)

圖2 TUNEL法檢測(cè)腎臟組織凋亡(×200)

2.3PDS對(duì)腎功能的影響 血清BUN含量 LPS組〔(32.31±1.76)mmol/L〕明顯高于對(duì)照組〔(11.83±0.99)mmol/L〕(P<0.01)，而PDS+LPS組的BUN含量〔(24.95±2.61)mmol/L〕顯著地低于LPS組(P<0.05)。血清的CREA含量以LPS組為最高〔(44.15±2.87)μmol/L〕，與對(duì)照組〔(16.16±1.43)μmol/L〕比較差異極為顯著(P<0.01)，PDS+LPS組〔(32.60±2.80)μmol/L〕明顯低于LPS組(P<0.05)。

2.4PDS對(duì)肝功能的影響 血清ALT活性，LPS組〔(73.29±4.00)IU/L〕與對(duì)照組〔(36.37±3.61)IU/L〕比較顯著增高(P<0.01)，PDS+LPS組ATL活性〔(70.09±5.25)IU/L〕與LPS組比較僅有下降趨勢(shì)。血清AST水平，LPS組〔(273.14±32.85)IU/L〕極顯著高于對(duì)照組〔(90.50±7.53)IU/L〕(P<0.01),PDS+LPS組〔(181.00±16.54)IU/L〕與LPS組比較明顯降低(P<0.05)。

2.5PDS對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響 LPS誘導(dǎo)AKI小鼠腎組織NO水平急劇增加。LPS組iNOS蛋白表達(dá)水平和NO含量與對(duì)照組比較明顯增加(P<0.01，P<0.05)，PDS+LPS組iNOS蛋白表達(dá)水平和NO含量均顯著低于LPS組(P<0.05)。LPS組腎臟MDA含量與對(duì)照組比較明顯增高(P<0.05)，SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達(dá)水平都明顯低于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)。見圖3，圖4。

圖3 PDS對(duì)LPS誘導(dǎo)AKI小鼠腎臟NO、mDA含量及SOD活性、Mn-SOD、iNOS表達(dá)水平的影響

1.對(duì)照組；2.LP組；3.PDS+LPS組

3 討 論

在膿毒血癥致病過(guò)程中，活性氧(ROS)主要通過(guò)以下途徑產(chǎn)生毒性作用：引起脂質(zhì)過(guò)氧化、激活凋亡通路、調(diào)整細(xì)胞內(nèi)鈣濃度、誘導(dǎo)黏附因子表達(dá)。氧化應(yīng)激也可以造成線粒體膜通透性增加，這會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)剩余的NAD+減少并伴隨其他基團(tuán)的產(chǎn)生。超氧化物和NO除了有致病作用，在正常的腎臟和血管中也發(fā)揮著生理功能〔5〕。研究表明，在實(shí)驗(yàn)性膿毒血癥AKI的腎損傷是潛在的、可逆的，早期的抗炎和抗氧化劑治療可以改善腎功能〔6〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明LPS(10 mg/kg)腹腔注射12 h不僅誘導(dǎo)出AKI，也導(dǎo)致了心、肝等多臟器的損傷；PDS有逆轉(zhuǎn)多臟器功能損傷的作用。

膿毒血癥性AKI的發(fā)病源于對(duì)促炎因子的反應(yīng)，包括細(xì)胞因子分泌和活性氮氧化物(RNOS)〔7〕。腎組織氧供除了用于線粒體的呼吸作用，還用于產(chǎn)生ROS和NO。除了有直接的舒血管作用外，經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞iNOS生成的NO還通過(guò)內(nèi)源的抗炎作用，阻止血管發(fā)生功能障礙。正如發(fā)生在缺血再灌注損傷和敗血癥時(shí)的情形，消耗iNOS相應(yīng)的輔酶因子會(huì)釋放內(nèi)皮細(xì)胞上的iNOS，進(jìn)而增強(qiáng)ROS的產(chǎn)量〔8〕。細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)多的NO可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)氧氣在線粒體中的細(xì)胞色素氧化酶抑制線粒體的呼吸作用，這種競(jìng)爭(zhēng)呈劑量依賴性〔9,10〕。在正常情況下，活性氧被少量釋放并且被內(nèi)生的抗氧化劑所拮抗，避免氧化應(yīng)激給組織帶來(lái)?yè)p傷。氧化應(yīng)激通常會(huì)導(dǎo)致腎細(xì)胞通過(guò)凋亡通路變性。凋亡誘發(fā)的氧化應(yīng)激和進(jìn)行性的線粒體功能紊亂是誘發(fā)腎病機(jī)制的基石。幾項(xiàng)研究共同表明，在急性、慢性腎病的細(xì)胞損傷中針對(duì)活性氧方面會(huì)對(duì)設(shè)計(jì)未來(lái)的治療方法有幫助。

Holthoff等〔11〕研究表明，白藜蘆醇通過(guò)抑制活性氮自由基(RNS)的活性實(shí)現(xiàn)了保護(hù)敗血癥性AKI的作用〔12〕。Wu等〔7,12〕研究顯示選擇性iNOS抑制劑(L-N6-(1-Iminoethyl)lysine，L-NIL)減輕了腎小管的氧化應(yīng)激，并糾正了微循環(huán)的異常。本研究發(fā)現(xiàn)PDS通過(guò)抑制腎臟iNOS表達(dá)，減少NO產(chǎn)生與釋放，改善了LPS誘導(dǎo)AKI小鼠的腎功能。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成的另一種氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，是氧化強(qiáng)化劑，在其作用下，大量的自由基能損傷DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)復(fù)合體，而且還會(huì)引發(fā)突變及凋亡的發(fā)生。組織MDA水平可代表組織的氧化應(yīng)激水平，本研究發(fā)現(xiàn)LPS組腎臟MDA含量與對(duì)照組比較明顯增高，而PDS+LPS組與LPS組比較MDA水平明顯減少。SOD為清除氧自由基的主要酶，而Mn-SOD為線粒體特異的捕捉氧自由基的酶，本研究發(fā)現(xiàn)LPS組SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達(dá)水平都明顯低于對(duì)照組。而PDS+LPS組SOD含量和Mn-SOD的蛋白表達(dá)水平都明顯高于LPS組，說(shuō)明LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激加重AKI小鼠的腎臟功能障礙，給予PDS通過(guò)抑制MDA的產(chǎn)生和上調(diào)SOD的表達(dá)和活性起到了抗氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)LPS誘導(dǎo)的AKI腎臟功能的作用。

PDS是從人參莖葉中提取的組合物，水溶性好，藥用價(jià)值高，無(wú)明顯毒副作用，保障了老年人用藥的安全性。近年有研究表明，PDS 具有抗血小板聚集、降血脂、對(duì)抗磷酸二酯酶、抗心律失常、抗心肌缺血、預(yù)防感染、提高機(jī)體免疫力等作用〔13～16〕。本研究室前期研究表明PDS對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠有明顯心肺保護(hù)作用〔17～19〕。本研究發(fā)現(xiàn)PDS有下調(diào)腎組織iNOS表達(dá)和上調(diào)Mn-SOD蛋白表達(dá)、減少NO及MDA生成的作用，從而減輕腎損傷。

綜上，PDS抑制氧化應(yīng)激可能是其保護(hù)LPS誘導(dǎo)AKI小鼠腎功能的機(jī)制，其具體的作用途徑仍需進(jìn)一步研究。

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