西妥昔單抗聯(lián)合塞來昔布對肺腺癌細(xì)胞KDR和AQP1表達(dá)的影響

陳 明 劉鳳華

(滄州市運(yùn)河區(qū)醫(yī)院外科，河北 唐山 063000)

肺癌治療失敗和死亡的主要原因肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，新生血管的生成在肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著極其重要的作用〔1，2〕。近年來研究表明水通道蛋白1(AQP1)和血管內(nèi)皮生長因子受體Ⅱ激酶功能區(qū)受體(VEGFR2/KDR)在許多腫瘤及其血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)升高，在促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖中起著關(guān)鍵作用〔3～6〕。本研究觀察西妥昔單抗、塞來昔布單獨(dú)及聯(lián)用時(shí)體外對肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡及KDR、AQP1基因和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞究所。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司。塞來昔布(江蘇恒瑞制藥有限公司)，西妥昔單抗(德國默克公司),青霉素(100 U/ml) (北京化工廠)，鏈霉素(100 U/ml) (Peprotech)，5%四甲基偶氮唑鹽(MTT 溶液,上海華美生物工程公司);流式細(xì)胞儀(COULTER XL;Coulter)；550酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)，生物倒置顯微鏡(Olympus CKX4)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 肺腺癌細(xì)胞株A549培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞以1×106/100 ml培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)24 h后如下分組進(jìn)行藥物處理，實(shí)驗(yàn)分為對照組(PBS液1 ml處理組)、西妥昔單抗1 nmol/L組、塞來昔布25 μmol/L組、西妥昔單抗1 nmol/L+塞來昔布25 μmol/L組,藥物濃度見參考文獻(xiàn)〔7，8〕。

1.3MTT比色實(shí)驗(yàn) 在96孔板上按5×104個(gè)/孔接種A549細(xì)胞，如1.2分組，每組設(shè)三個(gè)平行重復(fù)孔，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，生理鹽水漂洗一遍，每孔加MTT 20 μl(濃度為5 mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4 h后棄上清加入10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)200 μl，過夜。震蕩15 min，用全自動酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)檢測570 nm處的吸光度值(A值)。抑制率(%)=(A對照-A實(shí)驗(yàn))/(A對照-A空白)×100%。

1.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集如1.2分組的不同處理組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，冷PBS洗滌2次,加入70%的冷乙醇(4℃) 固定24 h。洗滌細(xì)胞，與含10 μg/ml RNA 酶的Tris-Hcl緩沖液(pH7.4) 共同孵育30 min。50 μg/ml 碘化丙啶(PI)進(jìn)行細(xì)胞DNA 染色，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量分布，計(jì)算出各個(gè)周期細(xì)胞的百分率。

1.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 在聚碳酸酯微孔濾膜上鋪Matrigel 50 μg/孔，在聚合好的小室下室加入10%的胎牛血清做條件培養(yǎng)液，在上室加入按如1.2分組處理過的A549細(xì)胞懸液100 μl(細(xì)胞總數(shù)為3×105/L)，置于培養(yǎng)箱中20 h后取出，用濕棉簽仔細(xì)擦掉上室中未穿過的瘤細(xì)胞，95%的乙醇固定5 min，PBS輕輕漂洗三遍，進(jìn)行HE染色，自然晾干，將上室的聚碳酸酯濾膜沿邊緣用手術(shù)刀片小心取下，用樹脂膠固定于玻片上(膜內(nèi)面朝上)，封片；高倍顯微鏡下記數(shù)穿膜的A549細(xì)胞數(shù)，每膜記數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)視野的侵襲細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，每組設(shè)三個(gè)濾膜。

1.6RT-PCR 將各組處理后的細(xì)胞懸液分別經(jīng)離心半徑16 cm,800 r/min,離心5 min,收集細(xì)胞,棄去上清后置于1 ml勻漿器中，加入1 ml Trizol試劑后研磨(冰盒上操作)。進(jìn)行RT-PCR分析。采用Trizol(Takara公司)試劑說明書介紹的方法提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA含量，利用 以總RNA 為模板、Oligo(dT) 為引物,應(yīng)用RT-PCR兩步法試劑盒(TaKaRa公司)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)參數(shù)：30℃，10 min→2℃，30 min→99℃，5 min→5℃，5 min。所得cDNA-20℃保存。以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，相關(guān)引物序列見(表1)。上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl，40 μl體系。擴(kuò)增參數(shù)：94℃，2 min,→(94℃，30 s→55℃,30 s→72℃，30 s)×45循環(huán)→72℃，5 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后用FR200圖像分析系統(tǒng)分析。

表1 引物序列

1.7Western印跡 在RT-PCR提取后剩余物中，加入適量裂解液及蛋白酶抑制劑，4℃ 、以1 500 r/min 離心30 min，取上清液。用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量后。將5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠60 V恒壓3.5 h，濕轉(zhuǎn)14 V恒壓14 h，37℃搖床封閉2 h，洗膜10 min，3次，轉(zhuǎn)印后加入一抗：KDR多克隆抗體(1∶1 000)或AQP1多克隆抗體4℃過夜(1∶1 000)；抗鼠β-actin(1∶5 000)4℃過夜。次日加入二抗山羊抗兔抗體(1∶700)，37℃搖床孵育1.5 h，TTBS洗3次×5 min，TBS液洗3次×5 min。將硝酸纖維素膜用發(fā)光液(Pierce,A、B各100 ml)充分潤濕后作用5 min，保鮮膜覆蓋，置暗盒中曝光5 min。顯影、水洗、定影后觀察結(jié)果，Quantity one圖像分析。目的條帶灰度值除以β-actin灰度值進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 肺腺癌A549細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡觀察，可見細(xì)胞生長旺盛，分布密集，大多呈多角形，細(xì)胞走向趨于一致，多角形細(xì)胞的胞體飽滿、有2～3個(gè)扁平而長的突起，細(xì)胞核較大，呈卵圓形且多居中(圖1)。

圖1 A549細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下形態(tài)(×200)

2.2各組A549細(xì)胞經(jīng)處理后的OD490值 西妥昔單抗+塞來昔布組抑制率明顯高于單用藥組(P均<0.05)，說明兩者聯(lián)合作用具有協(xié)同效應(yīng)。見表2。

表2 西妥藥單和塞米昔布抑制A549細(xì)胞后的OD490值

2.3流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期分布 G1期細(xì)胞用藥明顯多于對照組(P<0.05)，西妥昔單抗+塞來昔布組明顯多于西妥西單抗和塞來昔布組，而S期細(xì)胞相應(yīng)減少，差異有顯著性(P<0.05)，M期細(xì)胞無明顯變化，表明兩藥聯(lián)用的效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。見表3。

表3 西妥藥單和塞米昔布對A549細(xì)胞周期的影響

2.4A549細(xì)胞體外侵襲力的變化 對照組A549細(xì)胞穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)量較多(107.54±10.14)，西妥昔單抗組、塞米昔布組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(75.65±7.84，77.73±9.89)，西妥昔單抗+塞來昔布組穿膜細(xì)胞數(shù)最少(46.24±5.37)。表明西妥昔單抗+塞來昔布組兩藥聯(lián)用能更有效地降低A549細(xì)胞的侵襲力。見圖2。

圖2 不同處理組處理后A549細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

2.5AQP1、KDR mRNA及蛋白表達(dá) 經(jīng)過相關(guān)處理后，AQP1 mRNA、KDR mRNA及蛋白在西妥昔單抗+塞來昔布組表達(dá)量較西妥昔單抗組、塞來昔布組降低(P<0.05)。用藥組較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖3，表4。

1～4：對照組、西妥昔單抗組、塞米昔布組、西妥昔單抗+塞來昔布組

表4 AQP1 、 KDR mRNA蛋白在各組表達(dá)量

3 討 論

肺癌是一種臨床常見的肺部惡性腫瘤,其死亡率已占癌癥死亡率之首，可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占了到肺癌的85%以上。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。而腫瘤血管的生成在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用〔9〕。因?yàn)槟[瘤的持續(xù)生長必須依賴新生血管生成，大量的新生血管形成是體積>2 mm3的腫瘤繼續(xù)生長不可缺少的因素，沒有足夠的新生血管提供充足的養(yǎng)分，腫瘤的生長潛能將嚴(yán)格受到限制〔10，11〕。

近年來的研究表明KDR及AQP1與腫瘤血管生成關(guān)系密切，不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)KDR及AQP1，而且腫瘤細(xì)胞亦能表達(dá)〔12，13〕。其中AQP1是腫瘤血管生成的一種新的促進(jìn)因子，被認(rèn)為是血管增生的一種標(biāo)記物。目前大量研究表明許多腫瘤組織、癌細(xì)胞系及微血管內(nèi)皮細(xì)胞中AQP1 呈高度表達(dá)〔14，15〕,并且其表達(dá)量與腫瘤惡性程度有直接關(guān)系,惡性程度越高,AQP1 表達(dá)量越高〔16〕,提示應(yīng)用AQP的抑制劑或抗AQP抗體降低AQP1的表達(dá)將會是新的治療肺腺癌手段。KDR也是腫瘤血管生成過程中主要的調(diào)控因子之一〔17〕。腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，除了以旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮上的KDR，促進(jìn)血管形成外，還以自分泌的方式作用于自身細(xì)胞上的KDR，直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。另外研究發(fā)現(xiàn)阻斷KDR表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，抑制KDR表達(dá)，不僅可抑制腫瘤血管生成，而且也可阻止腫瘤細(xì)胞的生長從而阻斷肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。故以KDR為靶點(diǎn)抑制血管生成進(jìn)而控制腫瘤生長，對腫瘤治療和防止腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也有重要意義。

近年來研究表明，選擇性環(huán)氧化酶(COX)-2抑制劑塞來昔布對多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)分化、促進(jìn)凋亡作用〔18〕；西妥昔單抗是一種腫瘤分子靶向藥物，也廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床研究〔19〕。本實(shí)驗(yàn)將兩者聯(lián)合應(yīng)用于于A549細(xì)胞的體外培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞系的體外作用中，西妥昔單抗和塞來昔布都具有一定的抑瘤效應(yīng)，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，二者具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，可進(jìn)一步抑制細(xì)胞的生長和遷移。西妥昔單抗和塞來昔布單藥作用于A549細(xì)胞能夠明顯降低AQP1 和KDR基因和蛋白的表達(dá)水平，兩藥聯(lián)合時(shí)降低AQP1 和KDR基因和蛋白表達(dá)的作用更加明顯，提示降低AQP1 和KDR基因和蛋白的表達(dá)可能是兩者協(xié)同作用的分子機(jī)制之一。故將西妥昔單抗和塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用于肺腺癌的治療，能夠?yàn)榕R床提供有益思路。

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