核桃青皮提取物聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

王 爽 于洪泉 溫 娜 紀(jì)鵬艷 金 宏 王瑋瑤 曹志友

(吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，吉林 吉林 132013)

肺癌的發(fā)生與多種致病因素有關(guān)，化療在肺癌的治療中始終占有重要的地位。但由于化療藥物用量大，副作用多，很多患者難以忍受?，F(xiàn)代中藥研究表明，很多中藥成分都具有抗腫瘤作用，因此，人們對中藥抗腫瘤的研究越來越多。核桃青皮是民間密方白桃湯劑中的主要成分，故本實驗擬研究核桃青皮提取物誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的作用，為該藥抗腫瘤作用提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，小牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)，核桃青皮粉劑(吉林醫(yī)藥學(xué)院自制)，四甲基偶氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和順鉑(美國Sigma公司)。

1.2Lewis肺癌細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的Lewis肺癌細(xì)胞，37℃水浴振蕩至融解，然后將細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置入37℃、5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。

1.3MTT法檢測藥物對Lewis肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 稱取適量核桃青皮提取物，加入含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，配制成終濃度為0、1、2和4 μg/L的含藥培養(yǎng)基。將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/ml，將96孔板加入細(xì)胞懸液，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入含藥培養(yǎng)基，每個藥物濃度重復(fù)5次。分別于30 min、3、12、24 h終止反應(yīng)，每孔加入MTT 20 μl，37℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，搖床震蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度核桃青皮提取物對Lewis肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 核桃青皮提取物在作用Lewis肺癌細(xì)胞30 min、3 h、12 h和24 h，主要表現(xiàn)為對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。30 min時各藥物濃度組細(xì)胞生長并未表現(xiàn)出明顯的作用；3 h時各藥物濃度組細(xì)胞凋亡開始出現(xiàn)，以4 μg/L濃度組最明顯，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；12 h時各藥物濃度組細(xì)胞凋亡2和4 μg/L濃度組最明顯，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；24 h時各藥物濃度組細(xì)胞凋亡在1、2和4 μg/L濃度組明顯，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)。見圖1。

2.2核桃青皮提取物聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 0、1、2和4 μg/L核桃青皮提取物聯(lián)合順鉑作用Lewis肺癌細(xì)胞24 h，聯(lián)合用藥組細(xì)胞均明顯發(fā)生凋亡；與單獨應(yīng)用核桃青皮提取物組比較，2、4 μg/L濃度組細(xì)胞凋亡更加明顯(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

與0 μg/L組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

與未加順鉑組相比：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

自1972年Kerr等提出細(xì)胞凋亡的概念以來，學(xué)者們已逐漸認(rèn)識到腫瘤與凋亡的相關(guān)性〔1〕。促使腫瘤凋亡這種治療方式可以有效地保護(hù)人體正常細(xì)胞，對人體安全而無副作用。因此，凋亡現(xiàn)已成為抗腫瘤研究的熱點內(nèi)容之一。

核桃青皮是民間抗腫瘤常用的藥物之一。研究人員發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取物具有抗腫瘤作用。核桃青皮水提物抑制小鼠肉瘤S180和小鼠實體型肝癌的生長，并與所用劑量呈現(xiàn)一定的依賴關(guān)系〔2〕；核桃楸青皮水提物對機體有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可以降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度〔3，4〕。而從青核桃中分離出的物質(zhì)可以直接殺死體外培養(yǎng)的S180癌細(xì)胞，作用呈濃度時間依賴性〔5〕。

此前研究表明，核桃青皮提取物可以抑制腫瘤的體內(nèi)生長〔6〕，但機制不清。本實驗進(jìn)一步研究核桃青皮提取物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用，由于核桃青皮具有一定的毒性作用，本實驗使用低劑量的核桃青皮提取物，將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞經(jīng)低濃度核桃青皮提取物作用后，細(xì)胞明顯出現(xiàn)凋亡，并具有時顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。聯(lián)合常用化療藥物順鉑后，細(xì)胞均明顯發(fā)生凋亡；與單獨應(yīng)用核桃青皮提取物組比較，腫瘤細(xì)胞凋亡更加明顯。說明核桃青皮提取物具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，與鉑類化療藥中常用的順鉑有協(xié)同作用。但其對細(xì)胞的毒性作用還需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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