帕金森病小鼠黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細(xì)胞活化表達(dá)的炎性因子與多巴胺含量的關(guān)系

王 蓉 歐陽(yáng)敏 張 萍 王 瓊

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院老年病科，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

帕金森病(PD)是老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，60歲以后發(fā)病率高，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量〔1〕。中腦黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元缺失是其主要病理特征之一。自從在PD患者的中腦黑質(zhì)致密帶中發(fā)現(xiàn)了激活的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)以來(lái)，以MG激活為特征的神經(jīng)免疫炎癥機(jī)制受到了普遍關(guān)注。本文研究PD小鼠活化MG釋放的炎癥因子與黑質(zhì)紋狀體多巴胺含量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雄性健康C57BL/6小鼠40只，體重22～28 g，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，供以充足的食物和水，正常光照周期。前列腺素E2(PGE2)兔抗鼠多克隆抗體、腫瘤壞死因子(TNF)-α兔抗鼠多克隆抗體、白介素(IL)-1β兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物工程有限公司，中國(guó))，生物素化二抗(福州邁新公司)，碘酸鹽-賴(lài)氨酸-多聚甲醛固定液(實(shí)驗(yàn)室配制)，SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó))，百草枯(PQ，上?？婆d實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司，中國(guó))，NO試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1分組 40只小鼠隨機(jī)分為：模型組(n=20)：將百草枯(10 mg/kg)溶于5 ml生理鹽水配制成溶液，腹腔注射，2次/w，連續(xù)6 w。對(duì)照組(n=20)：給予等體積生理鹽水，2次/w，連續(xù)6 w。分別觀察小鼠行為學(xué)變化，行旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。兩組均在腹腔注藥后3、6 w時(shí)各處死10只小鼠。

1.2.2行為學(xué)檢測(cè) 腹腔注藥后第2、4、6周進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試。腹腔注射阿樸嗎啡0.5 mg/kg,10 min后開(kāi)始觀察并記錄大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，共記錄30 min，小鼠旋轉(zhuǎn)時(shí)以健側(cè)后肢為支點(diǎn)原地旋轉(zhuǎn)，身體環(huán)曲，首尾相接360 °為1轉(zhuǎn)(r)，旋轉(zhuǎn)>7 r/min或 210 r/30 min為成功PD模型。

1.2.3高效液相色譜檢測(cè)小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺含量 小鼠水合氯醛麻醉后取雙側(cè)黑質(zhì)、紋狀體，加入0.1 mol/L的高氯酸0.85 ml，研磨后上清于4℃低溫10 000 r/min離心30 min，取上清液，0.22 μm的濾膜過(guò)濾行高效液相檢測(cè)。參照峰值面積計(jì)算其測(cè)定值，以計(jì)算值/腦組織濕質(zhì)量(μg/g)表示。

1.2.4TNF-α、IL-1β、PGE2表達(dá)、MG測(cè)定 SABC法對(duì)黑質(zhì)致密部行切片染色，檢測(cè)TNF-α、IL-1β、PGE2表達(dá)和計(jì)數(shù)MG胞數(shù)：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，PBS洗3次×3 min。將切片浸入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，電爐加熱至沸騰后斷電冷卻5～10 min，反復(fù)1～2次。冷卻后PBS洗滌1～2次。滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次。滴加5%正常羊血清封閉，滴加適量稀釋過(guò)的兔抗鼠一抗，滴加生物素化羊抗兔二抗，室溫下孵育60 min。PBS洗3次×3 min。添加試劑SABC復(fù)合物室溫孵育60 min，蘇木素輕度復(fù)染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察，切片選取5個(gè)不重復(fù)高倍(40×10)視野，2人采用盲法分別計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。而MG切片必須來(lái)自過(guò)碘酸鹽-賴(lài)氨酸-多聚甲醛固定液處理的標(biāo)本。常規(guī)脫蠟入水后，處理方式與常規(guī)切片基本相同。光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野(10×40)，2人采用盲法進(jìn)行黑質(zhì)致密部MG計(jì)數(shù)。

1.2.5NO的測(cè)定 亞硝酸鹽作為NO穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物，通過(guò)溶液中的NO2-可與對(duì)氨基苯磺酸和N-(1-奈基)-乙二胺偶聯(lián)，生成紫紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在550～570 nm處存在較大吸收峰，將溶液在540 nm處比色，吸光度值的大小與NO2-的含量成正比，據(jù)此可檢測(cè)NO的生成量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)量資料數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠PD行為學(xué)檢測(cè) 模型組小鼠腹腔注射PQ后10～14 d有12只出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、 少動(dòng)、嗅探等異常行為，在4 w后的阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)證實(shí)其中的16只大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為，這說(shuō)明紋狀體-黑質(zhì)通路已經(jīng)受到損害，表明建模成功，成功率為80%。對(duì)照組大鼠無(wú)異常行為發(fā)生。

2.2小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺含量 腹腔注藥3、6 w后模型組小鼠腦內(nèi)多巴胺含量分別為(7.68±0.67)、(4.23±0.31)μg/g，均較對(duì)照組明顯減少〔(12.36±1.08)、(12.84±1.12)μg/g,P< 0.05〕。

2.3各組小鼠黑質(zhì)致密部MG計(jì)數(shù) 腹腔注藥3 w后模型組小鼠黑質(zhì)致密部MG數(shù)(38.50±3.23)與對(duì)照組(36.33±3.36)無(wú)明顯差異(P>0.05)，6 w后模型組小鼠黑質(zhì)致密部MG數(shù)(54.33±4.46)較對(duì)照組(38.80±3.42)明顯增加(P<0.05)。

2.4小鼠黑質(zhì)部TNF-α、IL-1β和PGE2表達(dá) 腹腔注藥3 w后模型組TNF-α和IL-1β表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)，6 w后模型組TNF-α和IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組均明顯增加(P<0.05)，腹腔注藥3 w和6 w后模型組PGE2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞與對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 小鼠黑質(zhì)部TNF-α、IL-1β和PGE2陽(yáng)性細(xì)胞

2.5小鼠黑質(zhì)部NO表達(dá) 腹腔注藥3、6 w后模型組NO表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(12.6、11.8)μmol/L與對(duì)照組(11.5、11.2)μmol/L比較，差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。

3 討 論

PD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多認(rèn)為可能與老化、遺傳和環(huán)境等因素有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，以MG過(guò)度激活為特征的神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)在PD的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。MG來(lái)源于間充質(zhì)中胚層的巨噬細(xì)胞，形態(tài)上主要分為分枝狀和阿米巴狀，前者為未被激活的MG，后者為阿米巴狀。未被激活的MG具有吞飲功能和一定的遷移能力，且廣泛而規(guī)律的分布在腦內(nèi)，對(duì)腦組織的代謝產(chǎn)物起到了凈化的作用。但它們對(duì)一些信號(hào)分子能迅速做出應(yīng)答，并對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的變化非常敏感。研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可能與其有CNS信號(hào)分子(ATP、CGRP、Ach等)的膜受體，膜通道(如鉀離子通道)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑(PTK、PLA2等)和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的激活等有關(guān)。受刺激后可迅速激活，具有變形和吞噬作用，并具有免疫監(jiān)視功能；受外界環(huán)境刺激后，MG在形態(tài)改變的同時(shí),其功能也發(fā)生了改變,細(xì)胞表面表達(dá)CR3補(bǔ)體受體和主要組織相容性復(fù)合物的分子水平上調(diào)，合成和分泌細(xì)胞因子的速度加快，如TNF-α，IL-1β等，這些細(xì)胞因子又可激活MG，使其釋放大量炎性因子，通過(guò)MG的激活分泌炎性因子調(diào)節(jié)微環(huán)境有其有利的一面，但持續(xù)地激活只能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和變性，其中的具體原因仍不清楚。但均認(rèn)為MG激活在PD發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段中均具有重要意義〔2〕。研究顯示PQ可經(jīng)血腦屏障主動(dòng)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病理提示PQ誘導(dǎo)的動(dòng)物模型病理結(jié)果顯示中毒的小鼠黑質(zhì)部位處于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧自由基大量生成，致使腦組織有大量壞死空腔，且與海馬神經(jīng)元的損傷呈相關(guān)性，這種氧化應(yīng)激引起了某些PD相關(guān)基因表達(dá)的變化〔3～5〕。

以往學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在早期PD患者中，膠質(zhì)增生與神經(jīng)元死亡具有相關(guān)性，MG可由神經(jīng)元的退變壞死所激活，一旦激活，會(huì)釋放大量細(xì)胞因子，使多巴胺能神經(jīng)元抗氧化損傷的能力明顯下降，而氧化應(yīng)激損傷又引起了某些PD相關(guān)基因表達(dá)的變化，激活的MG數(shù)明顯增高，且同時(shí)伴有多巴胺能神經(jīng)元的丟失；MG的激活可能主動(dòng)參與了多巴胺神經(jīng)元變性過(guò)程〔6～8〕。表達(dá)TNF-α和IL-1β的MG密度在PD患者的黑質(zhì)中增加，且有研究證實(shí)在脂多糖處理的小鼠中腦原代培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)有MG的激活和細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)表達(dá)的升高，伴隨有多巴胺能神經(jīng)元的死亡。本研究結(jié)果印證了既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論，MG的高度激活和數(shù)目增多參與PD的發(fā)病過(guò)程〔10〕。PGE2由COX-2表達(dá)，在有關(guān)PD模型中COX-2表達(dá)PGE2量減少可有效減少M(fèi)G的激活，從而保護(hù)了因過(guò)度炎性反應(yīng)引起的多巴胺神經(jīng)元受免疫性損傷。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，本研究認(rèn)為PGE2的表達(dá)與PD無(wú)明顯相關(guān)性，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)樣本研究明確機(jī)制。文獻(xiàn)顯示NO是一種活性因子，在病變?cè)缙谟捎诟邼舛鹊腘O導(dǎo)致產(chǎn)生谷氨酸鹽，誘導(dǎo)線粒體受損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)NO參與了早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變，隨病情的發(fā)展，表達(dá)水平回歸正常。

綜上，模型組小鼠黑質(zhì)致密部MG增生、激活，分泌炎性因子TNF-α和IL-1β，后兩者介導(dǎo)對(duì)神經(jīng)元的攻擊作用，加速了神經(jīng)元的變性和死亡，是導(dǎo)致PD患者發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。可以此為切入點(diǎn)進(jìn)行更深入的研究，從而改善PD的臨床治療。

4 參考文獻(xiàn)

1Hidle JV.Ageing,neurodegeneration and Parkingson's disease〔J〕.Age Ageing,2010；39(1):156-61.

2Tansey MG,Goldberg MS.Neuroinflammation in Parkingson's disease:it's role in neuronal death and implication for therapeutic intervention〔J〕.Neurobiol Dis,2010；20(37):510-8.

3陸明佳，朱 沂，孫 娟，等.小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)帕金森病模型小鼠的炎癥損傷〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011；15(11):1945-8.

4Lee HS,Lee KS,Yu K,etal.Expression of genes related to Parkinsons' disease after paraquat treatment in Drosophila melanogaster〔J〕.Pesticide Biochem Physiol,2008；92(1):19-23.

5莊文欣，付文玉，呂 娥，等.帕金森病小鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化〔J〕.解剖學(xué)報(bào),2010；41(3)：344-8.

6Cocheme HM,Murphy MP.Complex I is the major site of mitochondrial superoxide production by paraquat〔J〕.J Biol Chem,2008；283(4):1786-98.

7Ouchi Y,Yoshikawa E,Sekine Y,etal.Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease〔J〕.Ann Neurol,2005；57(2):168-75.

8Block ML,Zecca L,Hong JS,etal.Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms〔J〕.Nat Rev Neurosci，2007;8(1):57-69.

9汪錫金，陳生弟.帕金森病與膠質(zhì)細(xì)胞〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006；26(7):807-9.

10常宇濤，羅曉光，任 艷.激活小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)帕金森病模型小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響〔J〕.解剖科學(xué)進(jìn)展,2011；17(3):239-41,245.