N-乙酰半胱氨酸對(duì)人離體嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧和TLR4表達(dá)的影響

王春雷 呂 飛 張 燁

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目前對(duì)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)的治療尚無(wú)確實(shí)、有效的方法，主要藥物糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑藥物、抗氧化劑和細(xì)胞因子拮抗劑等〔1〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種較強(qiáng)的抗氧化劑，研究發(fā)現(xiàn)的NAC可能通過(guò)膜受體通道抑制細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶C及其上游的蛋白質(zhì)激酶，抑制中性白細(xì)胞釋放超氧陰離子的產(chǎn)生〔2〕。臨床研究結(jié)果也表明，NAC對(duì)IPF的肺功能惡化有明顯延緩作用，改善肺活量和彌散功能，尤其常規(guī)劑量的3倍以上(600 mg/d)，但其具體機(jī)制尚不明了〔3〕。Toll樣受體(TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)的先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨受體，能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子和損傷相分子，其中 TLR4在炎癥反應(yīng)中的作用尤為顯著〔4，5〕，最近研究發(fā)現(xiàn)TLR4在動(dòng)物急性或慢性炎癥和肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病中起到重要作用〔6〕。本研究探討NAC對(duì)人離體嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和TLR4表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 LPS及NAC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；人嗜中性粒細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自加拿大的Stemcell公司；單克隆MyD88和β-actin 購(gòu)自美國(guó)的Cell Signaling公司；二抗過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白G抗體購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Laboratories公司。Ficoll 購(gòu)自美國(guó)的GE公司。其他所有試劑均為分析級(jí)。

1.2密度梯度離心法分離嗜中性粒細(xì)胞 用密度梯度法分離正常健康人外周靜脈血的嗜中性白細(xì)胞。用Krebs-Ringer-phosphate 緩沖液(KRP；pH 7.4)沖洗細(xì)胞三次〔7〕；細(xì)胞計(jì)數(shù)使上述緩沖液中含嗜中性粒細(xì)胞數(shù)為1×106cells/ ml。

1.3用流式細(xì)胞儀方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氧自由基 用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度(50，100，150，200 μmol/L)NAC對(duì)嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響。在RPIM 1640培養(yǎng)基中加入上述分離細(xì)胞3×106，用10 μmol/L的 5-(and-6) -chloromethyl-29，79-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，acetyl ester (CM-H2DCFDA)處理10 min，再用1 μg/ml LPS和上述濃度的NAC處理細(xì)胞10 min。用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞二次。用ROS熒光探針二氫乙啶 (DHE)染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(CA)，激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：530 nm。LPS的熒光值為基礎(chǔ)值100%〔8〕。每個(gè)試驗(yàn)做5次，取平均值。

1.4Western印跡法檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞MyD88磷酸化的水平 1 ml的KRP預(yù)處理上述嗜中性粒細(xì)胞(1×106個(gè)/ ml)后，37℃下用1 μg/ml LPS孵化嗜中性粒細(xì)胞3 min ，加入不同濃度(50，100，150，200 μmol/L)的NAC，用45%三氯醋酸0.5 ml終止反應(yīng)(最終濃度為15%)。置于冰中反應(yīng)30 min后，在4℃下離心30 min，用1∶1(容量比)乙醚和乙醇的混合液沖洗三次，每個(gè)試管中加入蛋白質(zhì)溶解液(pH6.8)50 μl。用12% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)〔7〕，用轉(zhuǎn)寫(xiě)儀轉(zhuǎn)寫(xiě)到PVDF上，用5%蛋白液沖洗PVDF膜3次。用特異性抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)骨髓樣分化因子88(MyD88的磷酸化)。免疫熒光劑(ECL)檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化。

2 結(jié) 果

2.1NAC對(duì)人離體嗜中性粒細(xì)胞釋放超氧陰離子的作用 NAC呈劑量依賴(lài)性抑制LPS誘導(dǎo)的人嗜中性粒細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，濃度為50和100 μmol/L時(shí)，可明顯抑制ROS的產(chǎn)生可達(dá)到(80.1±5.5)%和(55.0±6.5)%，隨著濃度的增加，抑制越明顯，在濃度為150和200 μmol/L時(shí)，分別可達(dá)到(42.1±9.7)%和(30.2±13.3)%(P<0.01)。

2.2NAC對(duì)人離體嗜中性粒細(xì)胞MyD88磷酸化的影響 LPS可增加嗜中性粒細(xì)胞蛋白質(zhì)MyD88的磷酸化，NAC呈劑量依賴(lài)性抑制LPS誘導(dǎo)的人嗜中性粒細(xì)胞MyD88的磷酸化，濃度為50和100 μmol/L時(shí)，抑制程度達(dá)到(85.5±5.9)%、(51.7±7.8) %(P<0.01)，隨著濃度的增加，抑制越明顯，在濃度為150和200 μmol/L時(shí)，分別可達(dá)到(30.6±12.3) %和(10.2±3.3) %(P均<0.01)。NAC也呈劑量依賴(lài)性抑制MyD88的磷酸化，與抑制ROS相平行。見(jiàn)圖1。

1～6：空白組、LPS組、50、100、150、200 μmol/L NAC組

3 討 論

NAC為呼吸道黏液溶解劑，作用機(jī)制是分子中的巰基能使痰中黏蛋白的二巰鍵斷裂，使黏蛋白分解，對(duì)脫氧核糖核酸纖維亦有裂解作用。近年研究表明NAC和各種抗氧化藥物一樣可恢復(fù)人體內(nèi)耗竭的抗氧化劑水平，保護(hù)肺臟不受氧自由基的損傷。NAC具有抗炎作用，可抑制嗜中性粒細(xì)胞的功能，包括直接抑制黏附分子的表達(dá)和細(xì)胞遷移〔9〕。

肺纖維化的早期肺泡上皮細(xì)胞受損，就釋放血小板衍生因子PDGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFα、TGFβ、內(nèi)皮素-1，PGF2。Ⅰ型上皮細(xì)胞受損，Ⅱ型上皮細(xì)胞增生。中性粒細(xì)胞到達(dá)肺內(nèi)后，短時(shí)間內(nèi)就可釋放氧自由基，彈性硬蛋白酶、組織蛋白酶和膠原酶等，能損傷肺組織。嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別微生物的代謝產(chǎn)物，其中 TLR4主要通過(guò)MyD88依賴(lài)性途徑和非MyD88依賴(lài)性途徑激活下游的激酶，前者可激活NF-κB和MAPK信號(hào)通道，與嗜中性粒細(xì)胞釋放超氧陰離子有關(guān)〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑NAC可以通過(guò)抑制人嗜中性粒細(xì)胞TLR4-MyD88的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。結(jié)合以前的研究〔2，11〕，認(rèn)為NAC可能通過(guò)抑制人嗜中性粒細(xì)胞TLR4，從而抑制NADPH氧化酶亞單位p47phox的磷酸化和氧自由基的產(chǎn)生，與NAC的抗氧化作用可能與治療肺間質(zhì)纖維化有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

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