促紅細(xì)胞生成素對慢性環(huán)孢素A腎毒性細(xì)胞凋亡的抑制作用

崔鎮(zhèn)花 樸尚國 金英順 鄒洪斌 苗里寧 金 華 李 燦

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，吉林 延吉 133000)

環(huán)孢素A(CsA)作為一線免疫抑制劑，長期服用可導(dǎo)致慢性CsA腎毒性，其病理特點(diǎn)為腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化。慢性CsA腎毒性的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，由多種因素相互作用所致，包括炎性趨化因子〔1〕、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)〔2〕、腎素血管緊張素系統(tǒng) (RAS)〔3〕、細(xì)胞凋亡〔4〕等。在諸多發(fā)病分子機(jī)制中，細(xì)胞凋亡扮演著重要角色。CsA可以調(diào)控凋亡基因促使腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)入死亡程序，喪失過多的腎小管上皮細(xì)胞從而破壞腎臟正常結(jié)構(gòu)，最終形成纖維化。促紅細(xì)胞生成素(EPO)具有細(xì)胞保護(hù)作用，如保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷。給予大鼠EPO可減少腦梗死面積75%以上〔5〕和心肌細(xì)胞凋亡近50%〔6〕。另外，EPO可防治順鉑所致腎損傷〔7〕，EPO預(yù)處理可明顯減輕急性腎缺血再灌注損傷〔8〕。然而，關(guān)于EPO防治慢性腎臟損傷的報道較少。本實驗旨在探討EPO對慢性CsA腎毒性是否具有抗纖維化、抗細(xì)胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1實驗分組 雄性Sprague-Dawley 大鼠28只，體重200～220 g。喂飼低鹽飼料 (0.05% 鈉鹽，Teklad Premier，Madison，WI，美國) 1 w后，隨機(jī)分為四組：①對照組(n=6)：皮下注射橄欖油 (1 mg·kg-1·d-1，Sigma，美國)。②對照組+EPO(n=6)：給予橄欖油和EPO(100 U/kg，3次/w腹腔注射)。③CsA毒性組 (n=8)：皮下注射CsA(15 mg·kg-1·d-1，Novartis Pharma，Basel，瑞士)。④CsA+EPO組(n=8)：同時給予CsA和EPO。

各組大鼠4 w后處死，取血樣和腎組織標(biāo)本。CsA和EPO的劑量和用法選擇基于以往報道〔9，10〕。

1.2基本測定 監(jiān)測各組大鼠的體重變化；收縮期血壓 (SBP)，采用尾動脈測定法(Tail-cuff，BP2000，Visitech system，Apex，NC，美國) 檢測，每只大鼠測定3次取平均值。全血CsA濃度單克隆放免法測定(Monoclonal Radioimmunoassay，Incstar，Stillwater，MN，美國)。腎功能和血色素用全自動生化分析儀測定(Coulter-STKS，美國)。

1.3腎臟病理 獲取的腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液固定，石蠟包埋后切片(厚4 μm)。脫蠟后行三色(Masson Trichrome) 染色，觀察腎小管間質(zhì)纖維化。TUNEL染色按In Situ Apoptosis測定試劑盒(ApopTag Peroxidase，Intergen Co.，NY，美國)步驟說明檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡和腎小管間質(zhì)纖維化程度利用數(shù)字化顯微鏡分析儀 (TDI Scope Eye Version3.0 for Windows，Olympus，日本)，在100倍顯微鏡下，每張切片上至少觀察非重疊20個不同區(qū)域，獲取圖像，利用 Polygon 程序計算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和腎小管間質(zhì)纖維化的百分比(%/0.5 mm2)。由兩個觀察者對每個樣本隨機(jī)進(jìn)行盲法評分，取平均值。

1.4RNA 原位雜交 利用 DIG RNA 標(biāo)記的試劑盒制備 TGF-β1誘導(dǎo)基因h3(βig-h3) 特異探針，取石蠟包埋的切片按照常規(guī)方法進(jìn)行原位雜交。二甲苯脫蠟和梯度酒精中脫水，室溫下 (37℃) 0.3% 過氧化氫/甲醛30 min處理后，PBS液洗3次。置微波爐中加熱5 min修復(fù)抗原(98℃)，PBS 液洗3次。分別置0.2 mol/L鹽酸和1%Triton X-100溶液中15 min，室溫下與10 μg/ml蛋白酶K (Boehringer Mannheim，Mannheim，德國) 浸漬20 min，2倍SSC溶液沖洗后在含有50%去離子的甲醛、4倍SSC、2倍Dehardt’s、1 mg/ml salmon-sperm DNA、1 mg/ml yeast transfer RNA液中與0.3 ng/μl digoxigenin-labeled sense或抗βig-h3特異探針過夜進(jìn)行雜交。室溫下切片0.1倍SSC沖洗后，雜交過的探針用羊抗-DIG抗體(Fab)結(jié)合堿性磷酸酶標(biāo)記，以NBT/X-磷酸酶(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國)顯影。

1.5免疫印跡法 腎組織用蛋白質(zhì)溶解緩沖液 (10 mmol/L Tri-Cl，pH7.6；150 mmol/L NaCl；1% Sodium deoxycholate；1% Triton X 100；0.1% Sodium dodecyl sulfate；1% aprotinin；2 mmol/L Na3VO4；1 μg/ml leupeptin；1 mmol/L PMSF) 制成勻漿；4℃離心(1 500 r/min) 后，取上清液測定蛋白濃度 (Bio-Rad，Hercules)；20 μg 標(biāo)本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；電轉(zhuǎn)膜 (90 V) 2 h后，4℃下 置Bcl-2抗體于非脂牛乳中以1∶1 000 濃度孵育12～16 h；室溫下緩沖液洗3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG (Amersham Biosciences Buckinghamshire，英國)以1∶2 000濃度孵育1 h；室溫下緩沖液液洗3次，增強(qiáng)發(fā)光 (ECLTM，Amersham Biosciences，Seoul，韓國) 和曝光。Bax、Fas、βig-h3的免疫印跡方法與Bcl-2類似。以β-actin為參照，對照組為100%標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié) 果

2.1EPO對體重、血壓、貧血、腎功能的影響 CsA腎毒性組大鼠體重下降、 貧血、腎功能惡化。EPO治療明顯改善CsA所致的貧血和體重下降，但不能改善腎功能；然而各組間血壓無顯著性差異。見表1。

表1 各組大鼠腎功能及基本數(shù)據(jù)變化

2.2EPO對腎小管間質(zhì)纖維化的影響 與對照組相比，CsA毒性組表現(xiàn)為明顯的纖維化形成〔(23±3)% vs.(0±0)%，P<0.01〕；EPO〔(10±2)% vs.(23±3)%，P<0.05〕顯著減少纖維化程度。

2.3EPO對βig-h3表達(dá)的影響 RNA 原位雜交顯示CsA明顯增加βig-h3 mRNA的表達(dá)，而EPO抑制其表達(dá)。與RNA 原位雜交結(jié)果一致，免疫印跡結(jié)果表明EPO明顯抑制βig-h3蛋白的表達(dá)〔(290±27)% vs.(637±84)%，P<0.01〕。

2.4EPO對細(xì)胞凋亡的影響 CsA促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的增加〔(56.2±6.4) vs.(11.0±0.8)，P<0.01〕，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞，EPO顯著減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)〔(30.8±4.9) vs.(56.2±6.4)，P<0.05〕。

2.5EPO對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對照組相比，CsA不僅引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而且還調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，表現(xiàn)為抑制抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-2的表達(dá)〔(33±4)% vs.(100±6)%，P<0.01〕，反之上調(diào)促凋亡基因Bax〔(784±57)% vs.(100±10)%，P<0.01〕和Fas的表達(dá)〔(279±36)% vs.(98±15)%，P<0.01〕；EPO治療逆轉(zhuǎn)上述基因的表達(dá)。

2.6相關(guān)關(guān)系 直線相關(guān)分析表明，腎間質(zhì)纖維化程度與βig-h3蛋白表達(dá)(r=0.835，P<0.001)、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)正相相關(guān)(r=0.698，P<0.001)。

3 討 論

作為抗貧血藥物，EPO常用于治療慢性腎衰竭病人，本研究結(jié)果表明，EPO明顯減少腎小管間質(zhì)纖維化，而腎小管間質(zhì)纖維化程度與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)；在分子水平上，EPO抑制βig-h3的表達(dá)，同時調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡。因此，本文提示EPO對慢性CsA腎毒性具有抗纖維化作用。

致纖因子TGF-β1參與了各種慢性腎臟疾病的腎小球硬化和纖維化過程如糖尿病腎病〔11〕、單側(cè)輸尿管梗阻〔12〕、慢性CsA腎毒性〔2〕，但是組織器官中的TGF-β1并不具有生物學(xué)活性，需體內(nèi)激活。βig-h3是一種基質(zhì)蛋白，被TGF-β1調(diào)控，大量研究表明，βig-h3可用來真實地反映TGF-β1的生物學(xué)活性，在慢性CsA腎毒性腎小管間質(zhì)纖維化中起著重要作用〔13〕。本實驗結(jié)果表明，EPO治療明顯改善CsA所致的腎小管間質(zhì)纖維化，同時βig-h3 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)。所以，在慢性CsA腎毒性中，EPO抑制βig-h3的表達(dá)而發(fā)揮抗纖維化作用。

細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因在慢性CsA腎毒性腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病中起到重要作用。CsA可直接地引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡。Ortiz 等〔14〕報道給予小鼠近曲腎小管上皮MCT細(xì)胞CsA導(dǎo)致劑量和時間依賴性的細(xì)胞凋亡。另外，CsA還可通過 TGF-β1 間接地引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，給予ICR小鼠特異性抗 TGF-β單克隆抗體明顯減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡近48%〔15〕。在慢性CsA腎毒性中，本課題組曾報道細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas等參與了腎小管間質(zhì)纖維化過程〔16〕。在本實驗中，免疫印跡結(jié)果表明EPO上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，抑制凋亡基因Bax和Fas的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比率增加，有利于細(xì)胞存活，表明EPO通過調(diào)控Bcl-2/Bax和Fas減少細(xì)胞凋亡。

Parsa等〔17〕和Yang等〔18〕分別報道EPO抑制缺血所致腎小管上皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞凋亡而不依賴于其抗貧血作用，說明EPO具有直接的抗細(xì)胞凋亡作用。筆者推測EPO可通過改善腎缺血缺氧、減少氧化應(yīng)激等機(jī)制糾正貧血，改善了慢性CsA腎毒性。有趣的是，EPO減少CsA導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)纖維化，但病理學(xué)改善并不伴有腎功能的好轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象可能與慢性CsA腎毒性的動物模型特點(diǎn)相關(guān)，因為慢性CsA腎毒性動物模型僅在低鹽飼料下才能誘導(dǎo)。低鹽飼料激活RAS，最終導(dǎo)致腎功能惡化和病理學(xué)改變，與在臨床上觀察到的慢性CsA腎毒性極為相似。但在該動物模型中，用洛沙坦阻斷RAS僅能改善腎臟結(jié)構(gòu)變化而不能逆轉(zhuǎn)腎功能惡化〔19〕。相反，使用特異性的血管內(nèi)皮素抗體能改善腎功能卻又不能改善腎小管間質(zhì)纖維化〔20〕。由此推斷EPO對慢性CsA腎毒性的保護(hù)作用是通過非血流動力學(xué)途徑完成的。

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