老年腎病綜合征患者血漿miRNA的異常表達(dá)與臨床意義

楊 軍 朱鐵錘 劉向東

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)2科，河南 新鄉(xiāng) 453100)

腎病綜合征如不及時進(jìn)行診療，發(fā)展到后期將會導(dǎo)致出現(xiàn)腎衰竭〔1,2〕。目前，對于老年腎病綜合征的診斷主要依靠臨床癥狀，靈敏性和特異性較低；腎活檢雖然準(zhǔn)確性較大，但為有創(chuàng)檢查，易出現(xiàn)并發(fā)癥。近年來，隨著血漿miRNA在許多疾病中研究的不斷深入，miRNA成為疾病診療研究的熱點(diǎn)之一〔3〕，但是在老年腎病綜合征中的研究較少。本研究通過觀察老年腎病綜合征患者中miRNA的表達(dá)差異，為miRNA在老年腎病綜合征診斷和預(yù)后判斷中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2012年3月至2013年3月住院治療的老年腎病綜合征患者60例作為研究組，年齡60～75〔平均(64.26±4.48)〕歲，男38例，女22例。選取同時期來我院進(jìn)行健康體檢的老年患者15例作為對照組，年齡60～73〔平均(63.37±4.24)歲〕，男10例，女5例。研究組患者均經(jīng)腎活檢確診，主要為膜性腎病(MN)、微小病變型腎病(MCNS)、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)各20例。兩組患者的年齡、性別無明顯差異，具有可比性(P>0.05)。但研究組的24 h尿蛋白、血漿白蛋白、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)與對照組相比存在明顯差異(P<0.05)。見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，并經(jīng)患者知情同意。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

1.2血漿標(biāo)本 用EDTA-K2血液采集管分別收集研究組患者治療前后的空腹靜脈血2 ml以及對照組靜脈空腹血2 ml，輕輕顛倒3次，1 500 r/min常溫離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)入新的無酶EP管中。12 000 r/min 4℃離心10 min，小心吸取上層清液轉(zhuǎn)入干凈的無酶EP管中。將離心好的血漿樣本分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑 DEPC水為美國AMRESCO公司產(chǎn)品； miRcute miRNAs提取分離試劑盒(DP501)購自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DDR037A)、TaKaRa PCR擴(kuò)增試劑盒(DDR420A)購自大連寶生物工程有限公司。選取鼠的miR-295-3p作為血漿miRNA的檢測內(nèi)參，其序列為：5'-AAAGUGCUACUACUUUUGAGUCU-3'，PCR引物均由上海生工生物工程公司合成，序列見表2。

表2 miRNA的序列及實(shí)時定量RT-PCR的引物序列

1.4血漿miRNAs分離和qRT-PCR 按照試劑盒的操作說明書進(jìn)行miRNAs的提取。逆轉(zhuǎn)錄體系： Template miRNA 2 μl，RT引物(1ug/μl)，3 μl，RNase-free ddH2O 6 μl，lin4 10 fmol，AMV引物 1 μl；反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為 16℃ 25 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃。PCR反應(yīng)液包含：ddH2O 8.0 μl，PCR前向、反向引物各0.50 μl，模板 cDNA 1.0 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)10.0 μl，反應(yīng)條件: 94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，72℃ 10 min，一共進(jìn)行45個循環(huán)。

數(shù)據(jù)分析采用公式：△Ct研究組= Ct研究組基因-Ct 研究組內(nèi)參照;△Ct對照組= Ct 對照組基因- Ct對照組內(nèi)參照; △△Ct =△Ct研究組-△Ct 對照組。

2 結(jié) 果

2.1三組miRNA在兩組血漿中的表達(dá)情況和診斷中的應(yīng)用 研究組血漿miR-181a， miR-192和miR-141的表達(dá)水平均較對照組明顯升高(P<0.01)。ROC曲線分析顯示他們作為診斷標(biāo)記物診斷老年腎病綜合征的診斷效能較高(AUC>0.9)，診斷特異性和敏感性達(dá)到90%～100%。見表3，圖1。

2.2三組血漿游離miRNA在不同腎病綜合征病理類型的表達(dá)水平 miR-181a在MN組患者血漿中表達(dá)水平明顯高于其他組，MCNS組血漿miR-141表達(dá)水平明顯高于其他組，F(xiàn)SGS組血漿miR-192表達(dá)水平明顯高于其他組。見圖2。

表3 兩組患者血漿miRNA表達(dá)水平的比較

圖1 血漿miRNA診斷老年腎病綜合征的ROC曲線

與FSGS、MCNS比較：1)P<0.005；與MN、MCNS比較：2)P<0.05；與MN和FSGS比較：3)P<0.05

2.3三種血漿游離miRNA與腎病綜合征治療的關(guān)系 研究組患者治療1個療程后，血漿miR-181a、miR-192、miR-141表達(dá)水平較治療前明顯降低(P<0.05)，且與對照組比較沒有顯著差異(P>0.05)。見圖3。

對照組比較：1)P<0.05；與術(shù)前比較：2)P<0.05

3 討 論

隨著人類對于疾病基因表達(dá)差異性的不斷研究，發(fā)現(xiàn)體液中miRNA與許多疾病存在明顯的相關(guān)性，逐步被應(yīng)用為疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志〔4,5〕。研究發(fā)現(xiàn)血液中的miRNA穩(wěn)定性高，耐酸、耐堿、耐高溫且抗RNA酶干擾性強(qiáng)，具有高度保守性的序列，準(zhǔn)確性高，并且創(chuàng)傷小，易獲取標(biāo)本。既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，血漿中一些miRNA與腎臟疾病存在明顯的相關(guān)性〔6～8〕。

通過既往相關(guān)研究報(bào)道和基因庫篩選，本研究選取miR-181a、miR-192和miR-141作為研究對象，發(fā)現(xiàn)老年腎病綜合征組血漿三種miRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高，ROC曲線發(fā)現(xiàn)其敏感度和特異度均在90%以上，可見三種miRNA可以顯著區(qū)分老年腎病綜合征患者和健康受檢者。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a、miR-192和miR-141可以通過誘導(dǎo)膠原的合成、激活TGF-β1和AKT等相關(guān)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生，但是具體在不同病理類型中的變化機(jī)制尚不清楚〔9～11〕。本研究結(jié)果將有助于差異表達(dá)miRNA在腎病綜合征病理分析中的應(yīng)用，并提示三種miRNA的表達(dá)水平與腎病綜合征治療的效果存在相關(guān)性。

總之，檢測血漿miRNA能特異和敏感診斷腎病綜合征，提示miRNA可以作為老年腎病綜合征診斷的一種非侵襲性的血漿標(biāo)志物，此外，血漿miRNAs與老年腎病綜合征的病理分型、臨床治療都有顯著的相關(guān)性。

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