膠質(zhì)瘤IDH1基因變異與Ki-67、微血管密度表達的相關(guān)性

王 均 楊小朋 鄭 勇 王繼超 魏文淵 洪 宇

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

膠質(zhì)瘤是臨床常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率較高，治療效果不佳。其細胞內(nèi)的IDH1基因易發(fā)生變異，主要是其R132位點發(fā)生點突變，并且約75%的惡性膠質(zhì)瘤被發(fā)現(xiàn)存在這些變異。通過多項臨床實驗研究表明IDH1基因變異可延長患者的生存期〔1〕。Ki-67是一種細胞核表達的抗原，是膠質(zhì)瘤細胞增殖活性評估的理想標(biāo)記物。Mastronardi等〔2〕研究表明Ki-67標(biāo)記指數(shù)(LI)增加，腫瘤的惡性程度增加，其可反映膠質(zhì)瘤的惡性程度及一定程度提示患者的預(yù)后。腫瘤微血管密度(MVD)是評估血管新生的方法，Leon等〔3〕研究顯示其也是評價患者預(yù)后的一個指標(biāo)，正常腦組織中也表達。IDH1基因變異與預(yù)后的具體作用機制仍不清楚，IDH1基因是否通過降低膠質(zhì)瘤的增殖活性降低腫瘤的惡性程度及改變患者的預(yù)后仍不清楚。

1 材料與方法

1.1材料 選取2011年1月至2012年6月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)標(biāo)本45例，已經(jīng)該院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。男性26例、女性19例，年齡24～72〔平均(46.37±3.23)〕歲。病理結(jié)果按照2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)腦腫瘤病理分級標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ級(毛細胞型星形細胞瘤)2例，Ⅱ級(彌漫性星形細胞瘤、纖維型星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤、室管膜瘤)16例，Ⅲ級(間變性星形細胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細胞瘤)10例，Ⅳ級(多形性膠質(zhì)母細胞瘤、膠質(zhì)肉瘤)12例，將Ⅰ,Ⅱ級歸為低級別,Ⅲ、Ⅳ級歸為高級別。分為變異組20例，Ⅱ級11例、Ⅲ級6例、Ⅳ級3例；未變異組20例，Ⅰ級2例、Ⅱ級5例、Ⅲ級4例、Ⅳ級9例。5例腦外傷內(nèi)減壓手術(shù)所取正常腦組織(額葉或顳葉)標(biāo)本為空白對照組。冰凍標(biāo)本采集后均迅速置于液氮中，-80℃凍存?zhèn)溆?。IDH1基因變異檢測工作已完成〔4〕。主要試劑有SP試劑盒及鼠抗人CD34、Ki-67單克隆抗體均從上海銳賽生物技術(shù)有限公司購得。

1.2MVD免疫組化染色及分析 組織標(biāo)本常規(guī)甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片機切片厚度4 μm，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)行CD34的免疫組化染色。操作步驟：切片脫蠟水化，蒸餾水中5 min，用蒸餾水配制新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min蒸餾水洗1次，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，滴加一抗，置4℃冰箱過夜，過夜后在37℃復(fù)溫45 min，PBS洗2次各5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗孵育30 min，PBS洗2次各5 min，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶孵育30 min，PBS洗2次各5 min，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蒸餾水洗終止染色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片，鏡檢。每組均有陽性及陰性對照，CD34表達陽性為微血管內(nèi)皮細胞染成棕黃色。鏡下微血管計數(shù)，按Weidner〔5〕血管計數(shù)法進行，低倍鏡下選擇5個CD34陽性染色最多的區(qū)域作為熱點，然后用高倍鏡(×200)在眼網(wǎng)格下0.25 mm2范圍內(nèi)計數(shù)，任何管腔或單一血管內(nèi)皮細胞被染成棕黃色作為一個微血管計數(shù)，5個高倍鏡視野下計數(shù)的微血管平均值作為此標(biāo)本的MVD。

1.3Ki-67檢測及結(jié)果分析 組織標(biāo)本運用SP法行Ki-67免疫組織化學(xué)染色，染色方法同血管密度檢測。Ki-67染色腫瘤細胞核有棕黃色著色為陽性，Ki-67 LI按照陽性細胞所占的百分比進行定量分析，由兩名經(jīng)驗豐富的病理學(xué)專業(yè)醫(yī)生在高倍鏡視野下(×400)計算每100個腫瘤細胞中Ki-67標(biāo)記陽性細胞所占的百分比，每個組織標(biāo)本任取10個高倍視野(×400)計數(shù)取平均值，兩者的計數(shù)取平均值。把Ki-67 LI分為4級：弱陽性(±)，陽性細胞數(shù)小于25%；陽性(+)，陽性細胞數(shù)25%～50%；中度陽性()，陽性細胞數(shù)50%～75%；強陽性()，陽性細胞數(shù)大于75%。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MVD檢測結(jié)果 變異組MVD較未變異組減低(t=2.328，P=0.025)，空白對照組較變異組及未變異組均降低 (P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ級別膠質(zhì)瘤MVD表達較高級別膠質(zhì)瘤低(23.94±8.03和45.54±8.19,t=-8.369,P<0.001)，MVD表達隨腫瘤級別增高而增加。見表1和圖1。

2.2Ki-67表達結(jié)果 Ki-67在空白對照組不表達，各級膠質(zhì)瘤中均有表達(圖2)，表達定位于細胞核，細胞核被染成棕黃色，變異組Ki-67表達較未變異組減低(t=2.134，P=0.039)。Ⅰ+Ⅱ級別膠質(zhì)瘤Ki-67表達較Ⅲ+Ⅳ級別膠質(zhì)瘤低〔(8.36%±2.84%)vs(25.55%±7.53%),t=9.138，P<0.001〕。Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤采用單因素方差分析比較Ki-67表達，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，膠質(zhì)瘤級別越高Ki-67蛋白表達也越高，見表1。變異組Ki-67表達弱陽性16例，陽性4例；非變異組弱陽性表達12例，陽性8例；兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=-1.363，P=0.173)。

Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅳ級

空白對照組 未變異組低級別膠質(zhì)瘤 未變異組高級別膠質(zhì)瘤

表1 各組Ki-67陽性細胞率及MVD表達比較

3 討 論

惡性膠質(zhì)瘤在每年新增原發(fā)惡性腦腫瘤中約占70%。最初發(fā)現(xiàn)IDH1基因突變是在膠質(zhì)瘤的亞型中大規(guī)?；驕y序〔6〕，IDH1基因變異主要發(fā)生在Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤中，較少在Ⅰ級膠質(zhì)瘤中發(fā)生。IDH1基因突變主要在R132位點，并且發(fā)現(xiàn)約75%的惡性膠質(zhì)瘤存在這類突變。學(xué)者發(fā)現(xiàn)IDH1基因變異發(fā)生在膠質(zhì)瘤形成的早期〔7〕，并通過多項臨床實驗研究表明IDH1基因通過降低NADPH的水平，從而增加膠質(zhì)瘤對于放療及化療的敏感性，延長患者的生存期〔8〕。

膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因分子水平相互作用的復(fù)雜過程，不同功能的基因或蛋白水平的相互誘導(dǎo)協(xié)同和拮抗。Ki-67是Gerdes等〔9〕發(fā)現(xiàn)的一種IgG1單克隆抗體，在增殖細胞中識別一種核心抗原的提呈，而在靜息狀態(tài)下的細胞中缺失。隨后的研究提示Ki-67在膠質(zhì)瘤中是重要的臨床標(biāo)記物之一〔10〕。現(xiàn)已被廣泛運用于膠質(zhì)瘤的診斷及預(yù)后評價中，同其他反映細胞增殖的臨床指標(biāo)如DNA聚合酶、細胞增殖核抗原(PCNA)等相比優(yōu)勢在于Ki-67半衰期較短，蛋白在增殖周期后降解迅速，能更好地反映腫瘤細胞的增殖活性及其惡性程度，提示患者的預(yù)后。Ki-67蛋白的高表達水平提示間變型星形細胞瘤患者存活時間較短〔11〕。MVD已被證實是評價侵襲性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)，有人認為血管密度可能與年齡、性別等有關(guān)，Duda等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的血管發(fā)達但分布不均，腫瘤組織邊緣血管豐富但也有無血管區(qū)域，且腫瘤的血管密度與腫瘤內(nèi)部的位置、患者性別和年齡之間無關(guān)聯(lián)，說明膠質(zhì)瘤的預(yù)后與年齡、性別等無關(guān)聯(lián)。新生血管為腫瘤的生長提供必需的氧和營養(yǎng)物質(zhì)，與多種類型腫瘤的轉(zhuǎn)移及生存期有關(guān)，新生血管的形成會發(fā)生多種生理和病理過程，血管的腫瘤的惡變和轉(zhuǎn)移都依賴血管的生成〔13～15〕。腫瘤血管發(fā)育不成熟導(dǎo)致其基底膜不完整或缺乏為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供直接的通道。大多數(shù)腫瘤的血管密度越高，是一個不利的預(yù)后指標(biāo)，它增加轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險，膠質(zhì)瘤也不例外。血管密度的檢測目前較常用的有抗血管內(nèi)皮細胞CD31、CD34抗原來標(biāo)記微血管，由于CD31標(biāo)記的內(nèi)皮細胞染色較淺〔16〕，計數(shù)時難度較大且增加誤差，因此本實驗用CD34標(biāo)記微血管。

本研究發(fā)現(xiàn)，變異組Ki-67蛋白表達較非變異組增高，并隨腫瘤級別增高而增高，這與Yan等〔17〕的研究在初級膠質(zhì)瘤IDH1基因突變組Ki-67蛋白表達顯著低于野生型組的結(jié)論相同，并且IDH1基因變異患者的生存期延長與IDH1基因突變伴隨增殖率降低有關(guān)。本研究結(jié)果表明腫瘤惡性程度越高Ki-67蛋白高表達，此結(jié)論與以往相關(guān)研究〔18～20〕結(jié)果相同。膠質(zhì)瘤細胞中Ki-67表達增高表明腫瘤細胞數(shù)量增多，細胞增殖活躍，惡性程度增加，預(yù)后較差。本實驗Ki-67表達較其他研究偏低，等級比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與陽性細胞的定義有關(guān)，由于一些染色較弱的陽性細胞被歸為陰性細胞。微血管在正常腦組織中也表達，但本實驗?zāi)z質(zhì)瘤標(biāo)本中表達明顯高于正常腦組織，說明膠質(zhì)瘤生長迅速所需營養(yǎng)物質(zhì)和耗氧增加，新生血管適應(yīng)性增多。隨腫瘤級別增高MVD有增高的趨勢，因此MVD可作為預(yù)測腫瘤惡性程度的指標(biāo)。IDH1基因變異影響新生血管的形成，導(dǎo)致腫瘤血管生成減低，侵襲性及惡性程度降低。Chaloob等〔21〕研究顯示MVD和Ki-67蛋白表達之間有顯著相關(guān)性，膠質(zhì)瘤細胞增殖能力增強，腫瘤新生血管密度增多。

本研究結(jié)果間接提示IDH1基因變異影響腫瘤的能量代謝，而能量代謝受阻降低細胞的增殖活性，使大量細胞處于休眠期，導(dǎo)致新生血管內(nèi)皮細胞分裂緩慢，新生腫瘤血管數(shù)量減低，惡變和轉(zhuǎn)移受到抑制，患者的預(yù)后較好。IDH1基因突變雖是一個良好的膠質(zhì)瘤臨床療效標(biāo)記物〔22～24〕，但其在膠質(zhì)瘤中的發(fā)生發(fā)展機制仍未完全清楚，本實驗證實基因突變對腫瘤增殖活性有一定影響，但尚需完全明確其對腫瘤增殖的影響。

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