參苓散對(duì)脾陰虛癡呆模型大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達(dá)的影響

侯永春 嚴(yán) 孜

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

老年性癡呆(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙學(xué)習(xí)和記憶能力減退〔1〕。中醫(yī)發(fā)現(xiàn)這一病癥與脾虛濕勝、腦竅失養(yǎng)癥狀相似；同時(shí)臨床上也多用補(bǔ)脾益腎增智的方劑。參苓散具有益心力，除謬忘，能飲食，延年益壽的功效。近幾年來發(fā)現(xiàn)大腦海馬區(qū)神經(jīng)因子數(shù)量減少和功能障礙在脾陰虛AD發(fā)生與發(fā)展中起到越來越重要的作用〔2〕。本研究觀察參苓散對(duì)脾陰虛AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，用免疫組化(SP)方法觀察大鼠海馬神經(jīng)因子表達(dá)的變化，為防治脾陰虛AD病提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只，江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)2011-50，體重(300±20)g，環(huán)境溫度(25±2)℃，自然晝夜節(jié)律，顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2藥品與試劑 參苓散(藥物包括茯苓、人參、甘草等份自配，常規(guī)水煎，藥液含生藥3.2 g/ml)和傷陰藥(吳茱萸、附子等，常規(guī)水煎，藥液含生藥1 g/ml)江西南華制藥有限公司；戊巴比妥鈉注射液，江西科倫藥業(yè)有限公司； 3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)；抗兔SP試劑盒,中性磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(均為中杉金橋)。

1.1.3儀器 2135型石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))，展片、烤片機(jī)(山東紅旗儀器廠，中國(guó))，DT10K型電子天平(江蘇常熟長(zhǎng)青儀器儀表廠，中國(guó))，恒溫箱兼培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠，中國(guó))，BX-41型顯微照相儀(OLYMOUS,日本),DB001型Morris水迷宮(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 48只健康雄性大鼠稱重后，隨機(jī)分成四組：空白組(空白對(duì)照)、陰虛組(脾陰虛)、AD組(脾陰虛+AD)和治療組(脾陰虛+AD+治療)，每組12只。

1.2.2動(dòng)物模型復(fù)制及給藥

1.2.2.1脾陰虛證模型 首先對(duì)陰虛組、AD組和治療組大鼠參照經(jīng)典的復(fù)合因素造模法〔3〕進(jìn)行脾陰虛模型的建立，分為脾氣虛和脾陰虛兩個(gè)階段。實(shí)驗(yàn)第1～15天為脾氣虛階段，大鼠單日自由游泳達(dá)到耐力極限，禁食飼料，喂甘蘭(30 g/只)；雙日予豬油脂灌服；空白組正常喂養(yǎng)，予等量生理鹽水灌服。第16～24天為脾陰虛階段，在脾氣虛的基礎(chǔ)上每日增加傷陰藥1 ml/100 g ，連續(xù)灌服。而空白組大鼠僅予等體積生理鹽水灌服。

1.2.2.2脾陰虛+AD模型 AD組、治療組大鼠繼續(xù)進(jìn)行AD模型〔4〕的建立， 用MILLIQ水將Aβ1～40稀釋成5 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)備用。大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后，固定到腦立體定位儀，常規(guī)備皮消毒，切開皮膚；選擇雙側(cè)海馬為注射靶區(qū)，取前囟后3.5 mm ，中線旁2.0 m ，門齒鉤平面低于耳間線平面3.3 mm 處鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面緩慢垂直進(jìn)針至硬腦膜下2.5 mm, AD各組每側(cè)予以2 μl 淀粉樣蛋白酶(Aβ1～40)溶液緩慢注入，留針以保證溶液充分彌散，緩慢撤針，縫合切口，皮下注射抗生素防止感染；空白組和陰虛組大鼠進(jìn)行同樣手術(shù)，僅注入等體積MILLIQ水,術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.2.3藥物干預(yù) 術(shù)后第4天對(duì)治療組大鼠給予中藥參苓散灌胃，每日1 ml/100 g, 持續(xù)10 d，而其余各組大鼠每日予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.4Morris水迷宮試驗(yàn) 采用Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠造模前、造模后、治療后學(xué)習(xí)記憶能力；具體方法參照Morris等〔5〕的方法，分別于AD造模術(shù)前、造模術(shù)后第3天及治療結(jié)束后評(píng)價(jià)各組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.2.5標(biāo)本制備 各組大鼠在進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，立即以致死量100 g/L水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時(shí)剪開右心耳，快速滴入37℃生理鹽水300 ml，無血污后改為滴入固定液4℃的多聚甲醛400 ml。待大鼠尾巴完全僵直時(shí)迅速斷頭，取出海馬組織，固定于4%多聚甲醛溶液中12～24 h，進(jìn)行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約3 μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，晾干后置于60℃的烤箱中烘烤備用。

1.2.6腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)免疫組化檢測(cè) 采用免疫組化SP法檢測(cè)BDNF及NGF的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑說明書操作要求進(jìn)行檢測(cè)。在海馬區(qū)隨機(jī)選擇8個(gè)視野，用顯微圖像分析系統(tǒng)下的目鏡，400倍顯微計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1定位航行試驗(yàn) 造模前各組大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性；造模后，陰虛組、AD組、治療組與空白組對(duì)比逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)。給予中藥參苓散灌胃后，與陰虛組、AD組相比，治療組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見表1。

表1 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較

2.2空間探索試驗(yàn) 造模前各組大鼠空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且有可比性。造模后，陰虛組、AD組、治療組與空白組對(duì)比穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)；其中治療組、AD組與陰虛組比較，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。給予中藥參苓散灌胃后，與陰虛組、AD組相比，治療組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2 造模前、后各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的比較次，n=12)

2.3各組大鼠BDNF、NGF表達(dá)情況 與空白組比較，陰虛組、AD組大鼠海馬BDNF、NGF表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；而治療組與陰虛組、AD組比較明顯上調(diào)(P<0.01)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠海馬組織BDNF、NGF免疫陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)比較

圖1 各組大鼠海馬區(qū)BNF、NGF表達(dá)比較(×400)

3 討 論

AD呈逐年上升的趨勢(shì)，至今還沒有令人滿意的治療方法，中藥方治療AD給人們提出了新思路。本研究結(jié)果表明參苓散灌服能夠明顯提高脾陰虛AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，改善認(rèn)知功能。

海馬結(jié)構(gòu)作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)中起關(guān)鍵作用，海馬神經(jīng)元損害可能是AD的重要病理基礎(chǔ)之一。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類對(duì)神經(jīng)有特異性的蛋白質(zhì)，BDNF和NGF就是其中的代表。隨著對(duì)其深入研究，人們發(fā)現(xiàn)它們具有明確的促進(jìn)和維持神經(jīng)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)和存活作用，在改善認(rèn)知功能方面也有重要作用〔6～8〕。但中藥方參苓散能否促進(jìn)慢性腦缺血大鼠BNF的表達(dá)，目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本研究結(jié)果提示參苓散能通過啟動(dòng)BDNF的表達(dá)加強(qiáng)腦缺血后的內(nèi)源性修復(fù)過程，這可能是內(nèi)服參苓散后機(jī)體對(duì)腦進(jìn)行保護(hù)作用的一種機(jī)制。

AD屬中醫(yī)學(xué)的“癡證”、“呆病”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為引起本病的基本原因是肝腎虧虛、氣血不足、經(jīng)脈失養(yǎng)、髓海不足。而脾胃為后天化生之源，脾胃氣健則先天腎氣充實(shí)，髓海得養(yǎng)。參苓散方中人參大補(bǔ)元?dú)猓陨袣?，健脾益肺，以助運(yùn)化，益智安神，以充髓海；更有茯苓協(xié)助利水滲濕，調(diào)補(bǔ)脾陰，益心脾而寧心安神，炙甘草益氣補(bǔ)中，調(diào)和諸藥，共奏健脾安神之功。

4 參考文獻(xiàn)

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