Notch通路對(duì)乙醛激活大鼠肝星狀細(xì)胞株的增殖及轉(zhuǎn)分化的影響

肖 斌 陳川寧 陶忠樺 李 洪

(瀘州醫(yī)學(xué)院新校區(qū)生物化學(xué)教研室及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

肝纖維化進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活、增殖與轉(zhuǎn)分化〔1，2〕。酒精性肝損害是造成肝纖維化的主要病因之一〔3〕。激活HSC導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵分子是乙醛〔3～5〕。TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是研究最為廣泛、最為透徹的引起HSC增殖活化和肝纖維化的信號(hào)途徑，Notch通路與肝纖維化的關(guān)系尚不明確。本文擬探討Notch通路對(duì)乙醛激活大鼠HSC細(xì)胞株的增殖及轉(zhuǎn)分化存在的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料 肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；DMEM高糖型培養(yǎng)基(GIBCO公司)；優(yōu)級(jí)胎牛血清(Hyclone公司)；MTT試劑瀘州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；40%乙醛購(gòu)自天津石英鐘廠；鼠Ⅰ型膠原蛋白(TIMP Ⅰ)、纖維黏連素(FN) ELISA試劑盒(美國(guó)ADL公司)；ReverTra Ace組合型RT-PCR試劑盒(BioBRK公司)；引物(上海生工)；內(nèi)參鼠 β-actin(北京三博遠(yuǎn)志)；TRIzol、預(yù)染Marker、Taq PCR MasterMix(TianGen公司)；內(nèi)參α-Tubulin抗體(Beyotime公司)；α-SMA多克隆抗體(ABZOOM公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(Cell Signaling)；蛋白質(zhì)Marker(BIO-RAD公司)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL，Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 以10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱(5% CO2)、37℃，1～2 d換液，2～3 d細(xì)胞傳代，0.25%胰酶消化細(xì)胞5～10 min，Hank液終止反應(yīng)。隨機(jī)分為對(duì)照組和乙醛刺激組，每組又隨機(jī)分為4組：空白組、TGF-β阻斷組(SB-431542 10 μmol/L)、Notch阻斷組(DAPT 200 nmol/L)和TGF+Notch阻斷組(SB-431542 10 μmol/L + DAPT 200 nmol/L)，每組至少三個(gè)樣本。調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為(1～2)×105后，各組細(xì)胞培養(yǎng)至融合度70%～80%時(shí)，0.4%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基同步化處理細(xì)胞12 h后，更換完全培養(yǎng)基。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，刺激組在對(duì)應(yīng)的抑制劑預(yù)處理1 h后給予乙醛刺激(終濃度200 μmol/L)，每12 h補(bǔ)加一次，刺激24 h。24 h后(共培養(yǎng)時(shí)間72 h)收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。

1.2.2MTT試驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)接種于96孔板內(nèi)，分組培養(yǎng)。加入乙醛刺激后12、24 h各收集一次。每孔總體積為200 μl，每孔加MTT溶液20 μl，繼續(xù)37℃孵育4 h后，吸棄孔內(nèi)上清液。每孔加150 μl DMSO，孔板搖床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)測(cè)定OD值，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm，參考波長(zhǎng)630 nm，酶標(biāo)儀所示OD值為OD570-OD630，以消除非特異性光吸收效應(yīng)。重復(fù)3次，每次3復(fù)孔，取3次平均值。

1.2.3ELISA試驗(yàn) 收集分組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，每組至少3復(fù)孔。取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加入50 μl的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加入50 μl樣品于空白微孔中；在樣品孔中加入10 μl的生物素標(biāo)記液；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入50～100 μl的酶標(biāo)記液；37℃孵育反應(yīng)60 min；在孔板搖床上用洗滌液清洗5次，每次靜置10～20 s；每孔加入底物(顯色劑)A、B液各50 μl；37℃避光孵育反應(yīng)15 min；每孔加入50 μl終止液，終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)450 nm測(cè)定各孔的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.4半定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR) ①提取總RNA：冰上收集細(xì)胞加入1 ml冰TRIzol勻漿，依次經(jīng)氯仿、異丙醇等抽提總RNA。②RT反應(yīng)體系20 μl：總RNA X μl (<1 μg)，RNase free H2O(11-X)μl，5×RT 緩沖液4 μl，dNTP Mixture(每個(gè) 10 mmol/L)2 μl，Super-RI 0.5 μl，RT-Enhancer 0.5 μl，Oligo(dT)18 (50 pmol/μl) 1 μl，ReverTra Ace 1 μl。反應(yīng)條件：30℃ 10 min，42℃30 min，99℃5min，4℃5 min。③PCR反應(yīng)體系20 μl：RT產(chǎn)物2 μl，RNase free H2O 6 μl，2×Taq PCR Mastermix 10 μl， 上、下游引物(10 pmol/μl)各1 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s,退火58℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，循環(huán)數(shù)30個(gè)，延伸72℃5 min。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)表1。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻，與PCR-Marker一起，在含1 mg/ml溴乙錠的3%瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外透射儀下觀察結(jié)果，并用Quantity One分析軟件拍照分析。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.2.5Western 印跡檢測(cè)效應(yīng)蛋白α-SMA的表達(dá) 分組培養(yǎng)、收集細(xì)胞。冰上刮取細(xì)胞，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，總量控制在300 μl，冰上振搖裂解30 min。4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液?？捡R斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并制備上樣液。采用10%SDS-PAGE垂直平板電泳分離蛋白質(zhì)，每孔蛋白上樣量為50 μg，濃縮膠80 V，分離膠120 V，電泳2～3 h后停止，并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)Western封閉液(5% BSA配制)封閉后，與α-SMA抗體孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 37℃振搖孵育1 h。在紅光源條件下將等量的化學(xué)發(fā)光A液和B液混合，潤(rùn)透PVDF膜后室溫作用1 min，暗室中Kodak X-ray film 壓片，放射自顯影5 min。定影后所得免疫印跡圖譜用Quantity One軟件分析，用每個(gè)目的蛋白條帶的灰度掃描值對(duì)比相應(yīng)的內(nèi)參α-Tubulin條帶的灰度值，得到目的蛋白灰度的標(biāo)化值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 結(jié)果顯示，阻斷劑組間細(xì)胞活性基本一致，加入阻斷劑細(xì)胞活性明顯下調(diào)，雙阻斷組細(xì)胞活性下調(diào)明顯；較對(duì)照組有明顯上調(diào)。見(jiàn)表2。

2.2ELISA法檢測(cè)TIMP-Ⅰ、FN 各阻斷組二者明顯下調(diào)，雙阻斷組下調(diào)更明顯，單阻斷組間含量基本一致。見(jiàn)表3。

表2 mTT檢測(cè)不同組別大鼠HSC-T6培養(yǎng)72 h后的MTT測(cè)定結(jié)果

2.3RT-PCR檢測(cè)Notch通路節(jié)點(diǎn)分子RBP-JK、Hes1及Smad3 見(jiàn)圖1，表4～表6。

RBP-JK結(jié)果顯示，乙醛刺激組與對(duì)照組相應(yīng)組間上調(diào)顯著性不大(P>0.05)；阻斷組較空白組下調(diào)明顯(P<0.05)，雙阻斷較單阻斷組下調(diào)更為明顯(P<0.05)；單阻斷組間差異不大(P>0.05)。Hes1結(jié)果顯示，乙醛刺激組較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)；TGF-β和Notch通路阻斷對(duì)乙醛刺激引起的Hes1上調(diào)均有明顯的抑制作用(P<0.05)，單阻斷組間有差異性，以Notch單阻斷下調(diào)為主(P<0.05)；雙阻斷與單阻斷組比較抑制作用更為明顯(P<0.05)。

圖1 不同阻斷條件下RBP-JK、Hes1及Smad3的PCR 圖譜

Smad3結(jié)果顯示，乙醛刺激組較對(duì)照組Smad3有明顯上調(diào)(P<0.05)；TGF-β和Notch通路阻斷明顯下調(diào)乙醛刺激對(duì)Smad3轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)；單阻斷組間差異性不大(P>0.05)，雙阻斷組較單阻斷的Smad3下調(diào)更為明顯(P<0.05)。

2.4Western 印跡方法檢測(cè)效應(yīng)蛋白α-SMA 乙醛刺激明顯促進(jìn)α-SMA上調(diào)表達(dá)量(P<0.05)；TGF-β和Notch通路阻斷明顯抑制乙醛刺激對(duì)α-SMA的表達(dá)(P<0.05)，雙阻斷組及Notch單阻斷組抑制α-SMA蛋白表達(dá)更為明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表7。

圖2 不同阻斷條件下α-SMA的Western印跡

表3 不同組別大鼠HSC-T6培養(yǎng)72 h后的TIMP Ⅰ、FN測(cè)定結(jié)果

表4 不同阻斷條件下RBP-JK的PCR 相對(duì)灰度值

表5 不同阻斷條件下Hes1的PCR相對(duì)灰度值

表6 不同阻斷條件下Smad3的PCR 相對(duì)灰度值

表7 不同阻斷條件下α-SMA的Western印跡相對(duì)灰度值

3 討 論

各種損傷刺激通過(guò)不同或相同的HSC信號(hào)通路介導(dǎo)了HSC的激活,并使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,合成大量細(xì)胞外基質(zhì)成分(ECM)。膠原代謝的異常和ECM構(gòu)成變化是肝纖維化形成的主要特征，現(xiàn)已證明HSC是主要的ECM 生成細(xì)胞，其激活和分泌活動(dòng)增加是肝纖維化病理發(fā)生機(jī)制的重要環(huán)節(jié)〔6〕。

本文結(jié)果表明兩種阻斷劑作用的TGF通路與Notch通路介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均可抑制HSC增殖活性，而且兩條通路間可能存在協(xié)同作用；發(fā)現(xiàn)TGF通路與Notch通路介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)ECM的表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用，但是以TGF-β通路介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為主，也說(shuō)明Notch通路介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)HSC增殖有著非常重要的作用。

在哺乳動(dòng)物和人類Notch配體為Jaggedl〔7〕。Notch與Jagged1結(jié)合后，分三步酶切(S1、S2、S3位點(diǎn)三步裂解)后，釋放Notch受體胞內(nèi)區(qū)的活化形式(NICD)直接進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)其RAM結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合蛋白R(shí)BP-Jk/CBF-1相互作用，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平〔8〕。

本實(shí)驗(yàn)表明，在TGF-β通路中的HSC活化后可加入拮抗劑阻止Hes1表達(dá)，TGF-β通路對(duì)Notch通路在Hes1的調(diào)節(jié)可能具有協(xié)同作用。Smad3-mRNA水平也出現(xiàn)同樣的結(jié)果，提示Jagged1/Notch信號(hào)通路和由TGF-β/Smad3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子Hes1轉(zhuǎn)錄阻遏存在著協(xié)調(diào)性〔9〕。

目前公認(rèn)的肝纖維化形成機(jī)制是從HSC的瀑布樣激活效應(yīng)開(kāi)始的。TGF-β激活HSC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)過(guò)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體及其下游效應(yīng)分子，即Smads蛋白家族，啟動(dòng)膠原基因表達(dá)〔10〕。

HSC激活并轉(zhuǎn)變成具有增生活性的、產(chǎn)生纖維的具有收縮特性的肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α-SMA合成大量細(xì)胞外基質(zhì)ECM。因此，α-SMA被認(rèn)為是HSC活化的標(biāo)志〔11〕。阻斷Notch通路對(duì)TGF-β通路活化導(dǎo)致α-SMA效應(yīng)蛋白增加也有明顯的下調(diào)作用，說(shuō)明Notch通路對(duì)α-SMA具有調(diào)節(jié)作用；雙阻斷較TGF-β單阻斷對(duì)α-SMA表達(dá)上調(diào)的抑制作用更明顯，表明二種阻斷劑具有協(xié)同作用，但作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的后續(xù)實(shí)驗(yàn)闡明。

TGF-β1是致纖維化的關(guān)鍵因子，由于TGF-β及其胞內(nèi)信號(hào)分子Smads作用廣泛，單純抑制引起嚴(yán)重后果，長(zhǎng)期直接干預(yù)TGF-β及其下游分子Smads可出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)〔12〕；另外，由于TGF-β對(duì)維持成纖維細(xì)胞表型沒(méi)有顯著作用〔13〕。因此，針對(duì)TGF-β及Smads治療僅阻斷纖維化起始及過(guò)程，不能逆轉(zhuǎn)纖維化〔14〕。

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