蟲草素對小鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及炎癥調(diào)節(jié)

鄧 昌 歐陽波 陶 然 余順治 金 華

(昆明市官渡區(qū)人民醫(yī)院急診科，云南 昆明 650200)

腦缺血再灌注損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及一系列的病理生理變化，多種生物活性因子和細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與其中，如自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡、能量障礙、細(xì)胞炎癥、凋亡基因的激活和自噬的發(fā)生等〔1〕。其中炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔2〕。腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞會被激活，白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)等細(xì)胞因子參與其炎癥應(yīng)答過程〔3，4〕。許多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，阻斷腦缺血再灌注引發(fā)的炎癥應(yīng)答過程對腦組織具有保護(hù)作用〔2，5〕。因此，采取有效的干預(yù)措施阻斷炎癥應(yīng)答過程，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，是防治腦缺血再灌注損傷的一個(gè)重要策略。蛹蟲草是一種蟲草屬真菌，作為我國傳統(tǒng)中藥材的主要成分之一，被廣泛用于炎癥性疾病和癌癥的治療〔6〕。蟲草素是蛹蟲草的主要活性成分，具有抗菌、抗炎癥和清除活性氧自由基等作用〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素具有神經(jīng)保護(hù)作用，但對其在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制尚不清楚〔8〕。本研究旨在觀察蟲草素對小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能障礙及梗死灶體積的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為蟲草素用于缺血性腦卒中的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 MCAO栓線購于北京沙東生物技術(shù)有限公司；蟲草素和2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購于美國Sigma公司；NF-κB p65和Lamin B抗體購于美國Santa Cruz公司。其余藥品和試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 雄性C57BL/6小鼠96只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)和蟲草素預(yù)處理組(Cor)，其中Sham組有12只，Model和Cor組各有42只。各組根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)又分為缺血2 h(h)后再灌注0 h、6 h、12 h、24 h組。腦缺血再灌注損傷模型制作之前，Cor組小鼠經(jīng)灌胃給予蟲草素(10 mg/kg)7 d，每天一次。Model組小鼠接受生理鹽水灌注，其余過程與Cor組相同，Sham組不進(jìn)行腦缺血再灌注損傷，其余過程與Model組相同。

1.3動(dòng)物模型的制作 本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞模型，術(shù)中以肛溫計(jì)監(jiān)測體溫，并用白熾燈加熱維持肛溫在36℃～37 ℃。根據(jù)Longa線栓法加以改進(jìn)〔9〕。采用直徑0.32的栓線，采用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈后，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一切口，從中把栓線送入大腦中動(dòng)脈起始處，固定栓線，2 h后抽出栓線制備再灌注損傷模型。Sham組只分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，不閉塞大腦中動(dòng)脈。

1.4神經(jīng)功能缺損評分 腦缺血再灌注24 h后，采用Longa評分法對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評分〔9〕。該評分法分為5個(gè)等級：0分，正常，無神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，行走時(shí)，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分，行走時(shí)，向?qū)?cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.5腦梗死體積的計(jì)算 小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭、取腦，將腦組織置于-20℃中冷凍20 min后，置于腦切片模具內(nèi)，從額極開始由前向后間隔1 mm冠狀切取腦組織，置于37℃的2%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液中染色30 min。腦切片排序、拍照并輸入計(jì)算機(jī)，通過圖像分析系統(tǒng)對切片梗死體積和全腦梗死體積計(jì)算，各樣本以腦梗死體積/全腦體積比作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6腦組織IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1的檢測 小鼠腦缺血再灌注0 h、6 h、12 h和24 h后，斷頭開顱取鬧，分離缺血側(cè)大腦皮層組織。將皮層組織用4℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用ELISA法用于IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1含量的檢測，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書(博士德生物工程有限公司，武漢)的要求進(jìn)行。

1.7蛋白免疫印跡 小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭開顱取鬧，分離缺血側(cè)大腦皮層組織。采用核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒(博士德生物工程有限公司，武漢)制備核蛋白提取液，用于NF-κB活性的檢測。具體過程如下：BCA法行蛋白定量分析；配制10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜中；用10 %的脫脂奶4 ℃封閉過夜。然后分別加入NF-κB p65 (1∶500)和Lamin B(1∶1 000)的一抗封閉1 h，TTBS洗膜3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)的IgG抗體，于室溫輕搖1 h雜交反應(yīng)，TTBS洗膜6次，每次5 min；加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)5 min后保鮮膜包裹，暗室內(nèi)進(jìn)行X線膠片曝光、顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1蟲草素改善腦缺血再灌注損傷所致的神經(jīng)功能障礙與Sham組(0分)比較，腦缺血再灌注24 h后，Model組〔(3.3±0.5)分〕小鼠的神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重；而蟲草素的預(yù)處理(Cor組)〔(1.6±0.4)分〕可以顯著地改善腦缺血再灌注損傷所致的神經(jīng)功能障礙。

2.2蟲草素減少腦梗死灶體積 與Sham組相比，腦缺血再灌注24 h后，Model組(33%±4%)小鼠梗死灶體積顯著地增加；而與Model組比較，蟲草素的預(yù)處理(Cor組)(18%±2%)可以顯著地縮小腦缺血再灌注所致的梗死灶體積。

2.3蟲草素降低促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá) 如圖1所示，Model組小鼠在腦缺血再灌注0和6 h后，缺血側(cè)皮層組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著增加；在腦缺血再灌注12 h后，IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平開始下降。而與Model組相比，蟲草素的預(yù)處理(Cor組)可以顯著減低缺血側(cè)皮層組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。

2.4蟲草素增加抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá) 如圖1所示，Model組小鼠在腦缺血再灌注0、6、12和24 h后，缺血側(cè)皮層組織中IL-10和 TGF-β1的表達(dá)水平顯著增加，并都在6 h達(dá)到最高水平。而與Model組相比，蟲草素的預(yù)處理(Cor組)可以顯著增加缺血側(cè)皮層組織中IL-10和 TGF-β1的表達(dá)水平。

2.5蟲草素阻止NF-κB的活化 如圖2所示，與Sham組相比，Model組小鼠腦缺血再灌注24 h后，NF-κB的活性增強(qiáng)。而蟲草素的預(yù)處理(Cor組)可以抑制NF-κB的活性。

與Sham組比較：1)P<0.05；與Model組比較：2)P<0.05

圖2 蟲草素對缺血側(cè)皮層組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB水平的影響

3 討 論

蟲草素能抑制鏈球菌和炭疽桿菌等病菌的生長，具有抗癌活性，對內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。蟲草素的生物學(xué)功能主要依賴于其自身的抗氧化作用和抗炎癥活性。蟲草素的預(yù)處理可以減少血小板衍生生長因子所致氧自由基的產(chǎn)生〔10〕。蟲草素能抑制IL-1β介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答過程〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素可以保護(hù)沙鼠的海馬神經(jīng)元免受腦缺血損傷，但對其在小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制目前還不清楚〔8〕。在本實(shí)驗(yàn)中，蟲草素能通過抵抗炎癥反應(yīng)改善小鼠腦缺血再灌注損傷所致的行為障礙，減少腦梗死體積。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要原因之一〔12〕。腦缺血時(shí)血液炎癥細(xì)胞向腦內(nèi)浸潤，膠質(zhì)細(xì)胞被激活，引發(fā)腦組織炎癥反應(yīng)的失控，加重腦缺血再灌注損傷〔2，13〕。細(xì)胞因子在腦缺血的炎癥應(yīng)答過程中扮演著十分重要的作用。腦缺血會導(dǎo)致IL-1β和TNF-α等促炎癥因子的表達(dá)上調(diào)〔13～15〕。在短暫性局部腦缺血模型中IL-1β和TNF-α的表達(dá)被上調(diào)，并在再灌注數(shù)小時(shí)內(nèi)達(dá)到頂峰。IL-1β和TNF-α對腦缺血時(shí)嗜中性粒細(xì)胞的浸潤和膠質(zhì)細(xì)胞的激活起著十分關(guān)鍵的作用，IL-1β或TNF-α的抑制劑可以緩解腦缺血損傷〔16，17〕。腦缺血后炎癥應(yīng)答過程所致的損傷程度主要取決于促炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng)和抗炎癥因子的誘導(dǎo)作用〔2〕。抗炎癥因子IL-10和 TGF-β1對緩解腦缺血再灌注損傷具有重要的調(diào)控作用，外源性IL-10和 TGF-β1的給予可以抵抗腦缺血再灌注損傷〔18～21〕。許多研究已證實(shí)，IL-10能抑制促炎癥因子的產(chǎn)生〔22〕。在本實(shí)驗(yàn)中，蟲草素能顯著地上調(diào)抗炎癥因子IL-10和 TGF-β1的表達(dá)，并抑制促炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)。從中可推測，蟲草素可能通過抑制炎癥反應(yīng)過程，阻止嗜中性粒細(xì)胞的浸潤和膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而起到腦保護(hù)作用。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中。NF-κB的激活可以誘導(dǎo)多種促炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制因子IκB結(jié)合成復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中。在應(yīng)激條件下，NF-κB被激活，進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)。許多研究證實(shí)，腦缺血會導(dǎo)致NF-κB的活化，誘導(dǎo)多種促炎癥因子的表達(dá)，如IL-1β和TNF-α〔23，24〕。在本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血再灌注時(shí)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的含量顯著地增加，NF-κB被活化。這一結(jié)果與腦缺血再灌注所致IL-1β和TNF-α的上調(diào)具有同向變化趨勢。而蟲草素能顯著得抑制NF-κB的活化。這些研究結(jié)果表明，蟲草素可能通過抑制NF-κB的活化，下調(diào)促炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。

本研究表明，蟲草素對腦缺血再灌注損傷所致的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，可能通過降低促炎癥因子的表達(dá)，增加抗炎癥因子的表達(dá)，抑制NF-κB的活化，進(jìn)而起到腦保護(hù)作用。這些研究結(jié)果表明蟲草素可應(yīng)用于腦缺血性卒中的治療。

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