依達拉奉對認(rèn)知功能障礙小鼠海馬氧化應(yīng)激及神經(jīng)元再生的影響

孫 健 李 昱 賈 舒 宋貴軍

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科，遼寧 大連 116027)

認(rèn)知功能障礙是多種神經(jīng)疾病的常見表現(xiàn)，影響了患者生活質(zhì)量、增加家庭負(fù)擔(dān)，甚至可發(fā)展為阿爾茨海默病〔1〕。除神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病外，外傷及腦出血也可導(dǎo)致認(rèn)知障礙，其中病變神經(jīng)元未能完成被新生神經(jīng)元替代是影響認(rèn)知功能恢復(fù)的關(guān)鍵〔2〕。海馬在調(diào)控認(rèn)知的關(guān)鍵部位，該部位的神經(jīng)元再生情況是近年來的研究熱點〔3〕。氧化應(yīng)激在認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用，研究指出給予外源性自由基可促進神經(jīng)元再生，而在阿爾茨海默病模型中給予自由基清除劑可減弱Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，提示抗氧化是改善認(rèn)知障礙的可行措施〔4〕。依達拉奉(ED)是一種自由基清除劑，具有神經(jīng)保護作用，并推測其可能對認(rèn)知功能障礙的學(xué)習(xí)記憶功能損傷及神經(jīng)元再生有改善作用。本研究擬觀察ED對學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元再生的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取健康雄性ICR小鼠30只(購于北京維通利華公司)，體重25～30 g，采用側(cè)腦室注射Aβ25～35制備認(rèn)知障礙模型，隨機分為：模型組、ED低劑量(ED-L)組和高劑量(ED-H)組。其中ED-L組和ED-H組均在側(cè)腦室注射1 w后腹腔注射5 mg/kg和10 mg/kg ED(1次/d，連續(xù)4 w)，模型組僅給予等體積生理鹽水。同時選取10只同周齡ICR小鼠作對照(對照組)。實驗前所有大鼠均飼養(yǎng)穩(wěn)定1 w，各組大鼠均可自由獲取食物和水，且飼養(yǎng)條件相同。

1.2試劑 Aβ25～35購自美國Sigma公司；BCA蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)檢測試劑盒購自博士德生物技術(shù)有限公司，依達拉奉注射液購自江蘇先聲藥業(yè)生產(chǎn)公司，其他試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1認(rèn)知障礙小鼠模型制備 將預(yù)先溶解于雙蒸水中的Aβ25～35肽段(3 mmol/L)在37℃水浴中孵育，96 h后用于側(cè)腦室注射。待小鼠狀態(tài)穩(wěn)定后，給予2%水合氯醛腹腔麻醉(10～20 ml/kg)，待角膜反射消失后，置于立體定位儀，顱頂正中切開長約2 cm切口，暴露顱底頂，以前囟點為原點，根據(jù)小鼠側(cè)腦室坐標(biāo)(前囟點后0.3 mm，右側(cè)1 mm，深2.5 mm)微量注射Aβ25～35(總量約為5 nmol，體積控制在3 μl內(nèi))，留針不少于3 min，保證Aβ25～35進入側(cè)腦室。對照組的手術(shù)操作步驟相同，僅注射等體積的生理鹽水。術(shù)后縫合皮膚及常規(guī)消毒。

1.3.2學(xué)習(xí)和記憶功能檢測 采用Y型迷宮檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。預(yù)先將小鼠置于迷宮內(nèi)以適應(yīng)環(huán)境，3～5 min后給予適當(dāng)電壓電擊足部(約70 mV)，導(dǎo)致其向迷宮的3等分輻射式反射箱逃避，反射箱的3個輻射臂中僅有1個為安全，內(nèi)置于輻射臂中的信號燈亮提示安全。小鼠由電擊區(qū)域逃至無電輻射臂定義為正確反應(yīng)，其中連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)所需電擊次數(shù)為學(xué)習(xí)成績，而連續(xù)10次測試中的正確反應(yīng)次數(shù)為記憶成績，分別用于評價學(xué)習(xí)能力和記憶能力。

1.3.3ELISA法檢測海馬MDA、BDNF水平及SOD活性 將完成Y型迷宮的小鼠過量麻醉處死，迅速取出腦，用預(yù)冷PBS溶液沖洗血漬，放入液氮達到適當(dāng)硬度，取出海馬部位，冰上研磨并充分裂解，高速離心(12 000 r/min×20 min)，小心吸出上清液并等分為3份，分別用于檢測MDA、BDNF水平及SOD活性，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.3.4神經(jīng)元再生及活性氧檢測 用冰凍切片機對海馬進行冠狀連續(xù)切片(40 μm)，每5張保留1張，每個海馬取8張片，分別行特異性熒光探針DHE染色和DCX染色，置于高倍顯微鏡下，觀察各組的熒光強度、神經(jīng)元前體細(xì)胞的長度和密度。

2 結(jié) 果

2.1各組的學(xué)習(xí)和記憶成績 模型組的學(xué)習(xí)次數(shù)多于對照組，而記憶次數(shù)小于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的學(xué)習(xí)次數(shù)增多和記憶次數(shù)減少，ED-L組和ED-H組的學(xué)習(xí)次數(shù)少于模型組，記憶次數(shù)多于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對學(xué)習(xí)和記憶成績的改善效果強于ED-L組(P<0.05)，見表1。

表1 四組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶成績±s,n=10)

2.2各組海馬MDA、BDNF水平及SOD活性 模型組的海馬MDA水平高于對對照組，BDNF水平和SOD活性均低于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的MDA水平升高及BDNF水平和SOD活性降低， ED-L組和ED-H組的MDA水平低于模型組，BDNF水平和SOD活性均高于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對MDA、BDNF水平及SOD活性的改善效果強于ED-L組(P<0.05)，見表2。

表2 四組小鼠海馬的GAP-43、MDA水平及SOD活性±s,n=10)

2.3各組海馬的活性氧自由基水平比較 模型組的海馬熒光強度強于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的熒光強度增強，ED-L組和ED-H組的熒光強度均低于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對海馬增強熒光強度的減弱效果強于ED-L組(P<0.05)，見表3。

表3 四組小鼠海馬的DHE和DCX染色情況±s,n=10)

2.4各組海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長度和密度 模型組海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長度和密度均低于對照組(P<0.05)，給予ED處理可改善Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙引起的海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長度和密度降低，ED-L組和ED-H組的神經(jīng)突起長度和密度均高于模型組(P<0.05)，但仍與對照組有差異；ED-H組對神經(jīng)突起長度和密度的改善作用均強于ED-L組(P<0.05)，見表3。

3 討 論

ED是一種自由基清除劑，在臨床上用作腦保護劑，可保護神經(jīng)免受缺血缺氧導(dǎo)致的損傷。此外，其在臨床和動物試驗中對急性缺血性腦血管病有非常好的療效，并在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥也有滿意的治療作用〔6，7〕。除可減弱Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性外，ED還可降低NMDA誘導(dǎo)的cyt c釋放和細(xì)胞凋亡〔8〕。以上均提示ED在改善認(rèn)知障礙上有一定的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)：Aβ25～35處理可誘導(dǎo)認(rèn)知障礙，主要原因為Aβ25～35是淀粉樣蛋白的一種片段，可引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變，如神經(jīng)元胞體死亡、突觸丟失及繼發(fā)的學(xué)習(xí)記憶功能受損〔9〕。而給予ED處理后，Aβ25～35誘導(dǎo)認(rèn)知障礙成功后出現(xiàn)的學(xué)習(xí)記憶功能獲改善，提示ED對認(rèn)知障礙有改善作用，與之前的推測一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Aβ25～35處理后海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的神經(jīng)突起長度和密度均降低，而神經(jīng)元前體細(xì)胞是神經(jīng)元再生的基礎(chǔ)，表明認(rèn)知障礙小鼠的神經(jīng)元再生受抑制，是導(dǎo)致Aβ25～35處理小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶成績下降的根本原因，而給予ED處理后，可發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的突起長度和密度增加，同時BDNF水平升高，表明ED可促進海馬部位神經(jīng)元再生。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的自由基損傷在多種疾病的認(rèn)知障礙中有重要作用，而MDA水平和SOD活性是評價氧化應(yīng)激的經(jīng)典指標(biāo)〔10，11〕。本研究中Aβ25～35處理小鼠的MDA水平升高，SOD活性下降，提示Aβ25～35處理引起氧化應(yīng)激，ED處理后兩者異常水平均獲改善，表明ED對認(rèn)知障礙小鼠的海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激有改善作用，可能是其提高學(xué)習(xí)記憶功能及促進海馬神經(jīng)元再生的基礎(chǔ)。

綜上，ED可改善認(rèn)知功能障礙小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，可能是通過降低氧化應(yīng)激及促進海馬神經(jīng)元再生來實現(xiàn)的。

4 參考文獻

1沈小平,李艷平,徐麗君，等.急性腦梗死患者大腦中動脈微栓子與血管性認(rèn)知障礙的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(6):1400-1.

2陳 濤,周少華,劉南暖,等.促紅細(xì)胞生成素對慢性腦缺血大鼠認(rèn)知障礙及海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(7):1588-90.

3Christie BR，Cameron HA．Neurogenesis in the adult hippocampus〔J〕．Hippocampus，2006;16：199-207．

4付艷玲．氧化應(yīng)激與阿爾茨海默病以及抗氧化治療研究進展〔J〕．國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2010;37(4)：336-40．

5李 巖，孫圣剛，孔慶勝，等．依達拉奉、神經(jīng)節(jié)苷酯對帕金森病模型大鼠的神經(jīng)保護作用〔J〕．中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2010;19(4):317-8．

6李文格，王 卉，田笑虹，等．依達拉奉聯(lián)合疏血通注射液治療急性缺血性腦血管病40例〔J〕．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011;9(10)：1206-7．

7李 巖，孫圣剛，孔慶勝，等．依達拉奉、神經(jīng)節(jié)苷酯對帕金森病模型大鼠的神經(jīng)保護作用〔J〕．中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2010；19(4)：317-8．

8Nakano-Okuda Y,Hasegawa K,Hirai K,etal.Effects of edaravone on N-methyl-D-aspartate (NMDA)-mediated cytochrome c release and apoptosis in neonatal rat cerebrocortical slices 〔J〕. Int J Dev Neurosci,2006；24(6):349-56.

9Li X，Zuo PP．Effects of Aβ25-35 on neurogenesis in the adult mouse subventricular zone and dentate gyrus〔J〕．Neurol Res，2005；27：218-22．

10晏 濤，陳世保，徐 蕾，等．靈芝多糖對阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶和氧化應(yīng)激的影響〔J〕．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2011；40(4)：387-9，425．

11丁艷平，馬麗梅，李艷萍，等．黃芪注射液對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為及海馬區(qū)SOD活力和MDA含量的影響〔J〕．西北師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011；47(6)：75-9，115．