冬凌草甲素通過激活A(yù)TM蛋白誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期阻滯

王海艷 朱志兵

( 德州市人民醫(yī)院,山東 德州 253000)

冬凌草甲素(oridonin)，別名冬凌草素、延命草寧，是冬凌草的主要有效成分，為四環(huán)二萜類化合物。研究表明，冬凌草甲素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制或殺傷作用，具有明顯的細(xì)胞毒作用和較強(qiáng)的抗腫瘤活性〔1〕，冬凌草甲素對(duì) 20 余種人癌細(xì)胞株生長(zhǎng)均有明顯的直接抑制作用〔2〕，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如白血病細(xì)胞 NB4〔3〕、肝癌細(xì)胞 HepG2〔4〕、膀胱癌細(xì)胞MB49〔5〕、黑色素瘤細(xì)胞 A357-S2〔6〕等的增殖具有明顯抑制作用。 我們前期工作表明冬凌草甲素對(duì)人肝癌HepG2 細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用〔4〕。本課題在前期研究基礎(chǔ)觀察不同濃度的冬凌草甲素誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯和作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 冬凌草甲素購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)，用DMSO 溶解(濃度≤0.1%) ；DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；小牛血清(美國(guó)Gibco公司)；H2AX(1∶100；Cell Signalling)，γ-H2AX(1∶100；Cell Signalling)，Phos-S1981ATM(1∶100；Cell Signalling)，anti-p53(FL-353 at 1 μg/ml,Santa Cruz); anti-phospho-p53(S15) (1∶1 000,Cell Signaling)；anti-ATM (1∶500，Rockland), anti-phosph-CHK2 (T68) (1∶500，Cell Signalling), anti-CHK2 (1∶1 000，Cell Signalling),辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶1 000，SantaCruz Biotechnology 公司)； β-actin(美國(guó) Santa Cruz公司)； RNA酶、PI染液(美國(guó)Sigma 公司)。

1.2細(xì)胞系 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞接種于含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3Western印跡檢測(cè) p53、Cyclin A、 H2AX蛋白表達(dá) 不同濃度的冬凌草甲素(0、16、32、64 μmol/L)處理HepG2 細(xì)胞48 h 后， 收集2×106/ml細(xì)胞，總蛋白的提取用賽百勝公司的 Protein Extraction solution，并且用Bradford方法定量蛋白質(zhì)。上樣前取 20 μg 等量蛋白質(zhì)加上等體積 2×上樣緩沖液，于 95℃變性10 min后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后，恒流260 mA，90 min 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上，然后用含 5% BSA 的 TTBS 室溫封閉 1 h，進(jìn)行一抗孵育，將一抗按照推薦濃度溶于封閉液中,與對(duì)應(yīng)膜共同封閉在塑料袋中, 4℃下過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST(TBS+0.1% Tween20)漂洗膜4次，每次15 min。再使用對(duì)應(yīng)的二抗孵育,按照相應(yīng)比例稀釋(1∶1 000),室溫輕搖1 h，二抗孵育結(jié)束后，再用TBST漂洗膜4次，每次15 min。最后使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光顯色法對(duì)膜進(jìn)行顯色曝光。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變 不同濃度(16、32、64 μmol/L)冬凌草甲素處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞,冰PBS洗2次,用70%冰乙醇4℃固定1 h,冰PBS洗2次,用3 ml PBS重懸細(xì)胞加入RNA酶至終濃度為100 μg/L,37℃水浴30 min，加入PI至終濃度為50 μg/L,4℃避光30 min， 流式細(xì)胞儀上機(jī)，488 nm 波長(zhǎng)激發(fā)檢測(cè)細(xì)胞周期并分析。重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡結(jié)果 不同濃度的冬凌草甲素處理HepG2 細(xì)胞48 h后，Western印跡結(jié)果表明，隨著濃度的增加，Phos-S1981ATM、anti-phosph-CHK2 (T68)、anti-phosph-CHK2(T68)、Phos-p53和γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢(shì)(見圖1)。

圖1 Western 印跡結(jié)果

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果 不同濃度的冬凌草甲素(0、 16、32、64 μmol/L)處理HepG2 細(xì)胞48 h后，G2/M 期細(xì)胞比例分別為16.03%、26.01%和46.95%,呈逐漸增多趨勢(shì),而G0/G1期細(xì)胞呈相對(duì)減少趨勢(shì)。16、32和64 μmol/L 冬凌草甲素組G2/M 期細(xì)胞比例與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見表1。

表1 不同濃度冬凌草甲素對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響±s,%)

圖2 細(xì)胞周期流式圖

3 討 論

與其他一些常見的惡性腫瘤相比，肝癌的治療效果很差。外科手術(shù)仍然是最有可能為肝癌帶來(lái)治愈希望的治療手段。但是只有外科手術(shù)是不夠的，綜合治療必不可少，尋找肝癌治療的途徑勢(shì)在必行。我國(guó)對(duì)冬凌草及其有效成分的藥理研究始于20 世紀(jì)70 年代后期。此后，主要集中在對(duì)冬凌草甲素抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究上。既往多項(xiàng)體外試驗(yàn)表明,冬凌草甲素對(duì)多種人癌細(xì)胞株有生長(zhǎng)抑制效應(yīng)〔7,8〕。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，細(xì)胞的增生、分裂、變形、凋亡和壞死等生理或病理過程都發(fā)生在它所處的細(xì)胞周期的某一時(shí)相；若細(xì)胞周期的某一時(shí)相出現(xiàn)異常，細(xì)胞將進(jìn)入與之相關(guān)的病理過程〔9〕。細(xì)胞周期受體內(nèi)外多種因子、多層次調(diào)控，而細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。幾乎所有的腫瘤都有一個(gè)共同的特征： 細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞,導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長(zhǎng)。G/M期DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)是細(xì)胞周期運(yùn)行至有絲分裂前細(xì)胞自我修復(fù)的最后時(shí)機(jī)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，冬凌草甲素使細(xì)胞阻滯于G2/M 期,通過有絲分裂擾亂細(xì)胞進(jìn)程、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

細(xì)胞DNA在細(xì)胞周期運(yùn)行過程中不斷受到外源性和內(nèi)源性因素的損傷。DNA損傷后激活細(xì)胞周期損傷檢驗(yàn)點(diǎn)，啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，在進(jìn)入有絲分裂之前修復(fù)損傷的DNA，確保轉(zhuǎn)錄基因組的完整性，如果修復(fù)失敗或者損傷因素積累，損傷的基因會(huì)隨著細(xì)胞分裂遺傳給子代細(xì)胞，就可能導(dǎo)致無(wú)法控制的細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致癌變〔10〕。細(xì)胞周期中主要的細(xì)胞DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂前修復(fù)DNA損傷的最后時(shí)機(jī)〔11〕，共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ATM)和Rad-3相關(guān)蛋白(ATM and Rad-3 related,ATR)激酶可以感知DNA損傷,并將DNA損傷信號(hào)傳導(dǎo)到下游靶蛋白,啟動(dòng)應(yīng)激系統(tǒng),產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，從而完成DNA修復(fù)或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序〔12～14〕，因此ATM和ATR對(duì)維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定和防止腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要。

本研究Western印跡結(jié)果表明，隨著冬凌草甲素濃度的增加，Phos-S1981ATM、anti-phosph-CHK2 (T68)、anti-phosph-CHK2 (T68)、Phos- p53和γ-H2AX蛋白水平呈逐漸增加趨勢(shì)。由以上結(jié)果可以分析，冬凌草甲素通過激活A(yù)TM蛋白細(xì)胞信號(hào)通路，引起G2/M期阻滯而為損傷DNA修復(fù)提供時(shí)間。細(xì)胞內(nèi)激活各種檢驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)蛋白,觸發(fā)檢驗(yàn)點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活由ATM R調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白作用下，感應(yīng)蛋白將DNA損傷信號(hào)傳遞至信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，作用于相應(yīng)的效應(yīng)蛋白,通過“ATM-p53-CHK2”通路, 引起細(xì)胞周期G 期阻滯，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)，損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序激活。

本研究結(jié)果表明冬凌草甲素能夠通過激活A(yù)TM細(xì)胞信號(hào)通路、誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞發(fā)生阻滯，發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，從而調(diào)整細(xì)胞增殖與凋亡間的平衡。本試驗(yàn)結(jié)果為研究冬凌草甲素抗腫瘤作用分子藥理機(jī)制是否與分子靶標(biāo)有關(guān)提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

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