肝癌MHCC97H細(xì)胞中CD133+和CD133-亞群分選及其生物學(xué)特性

易善永 南克俊 張麗娟 柯 洋 姜麗麗

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450007)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中含有極少量腫瘤干細(xì)胞(CSC)，它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等過程中起決定性作用〔1～4〕。本研究旨在探討肝癌MHCC97H細(xì)胞中CD133+和CD133-亞群分選及其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 MHCC97H細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫；Balb/C裸鼠購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。鼠抗人CD133抗體、兔抗人Bmi抗體、鼠抗人SMO抗體、兔抗人Notch-1抗體、鼠抗人β-catenin抗體、鼠抗人Oct3/4抗體(R&D公司)。鼠抗人PE-CD133、CD133免疫磁珠細(xì)胞分選系統(tǒng)(Miltenyi公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2免疫磁珠法分選細(xì)胞 取呈對數(shù)生長期的人肝癌MHCC97H細(xì)胞株數(shù)瓶，胰酶消化，用0.4%臺盼蘭染色、計(jì)數(shù)，使細(xì)胞總量保持在1×108數(shù)量級。取上述準(zhǔn)備好的MHCC97H細(xì)胞，按100 μl/108的比例加入FcR阻斷試劑；5 min后按100 μl/108的比例加入交聯(lián)CD133抗體的微磁珠標(biāo)記MHCC97H細(xì)胞。充分混勻后在4～8℃冰箱內(nèi)孵育25 min。然后加入緩沖液進(jìn)行離心，棄上清，制成細(xì)胞懸液；過MACS分離柱分選MHCC97H細(xì)胞，并分別收集CD133+和CD133-細(xì)胞。

1.3流式細(xì)胞儀檢測分選前后CD133的表達(dá) 分別取培養(yǎng)的對數(shù)生長期的MHCC97H細(xì)胞和分選后的CD133+細(xì)胞，并制備成單細(xì)胞懸液。分別加入PE-CD133抗體，并在暗處室溫下孵育30 min。并洗去未結(jié)合的抗體，上流式細(xì)胞儀檢測，采集圖像及數(shù)據(jù)分析。

1.5細(xì)胞體外增殖能力的比較 分別將上述各種細(xì)胞種植到96孔板中，每組細(xì)胞種10個(gè)孔，使每孔1×104個(gè)細(xì)胞，加入干細(xì)胞培養(yǎng)液放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、3、5、7天用MTT比色法測定各組細(xì)胞的增殖狀態(tài)。以各組平均OD490 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6Western印跡法檢測干細(xì)胞相關(guān)基因蛋白的表達(dá) 將準(zhǔn)備好的細(xì)胞分別用胰酶進(jìn)行消化處理，然后用PBS緩沖液洗滌兩次，離心棄上清液。加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，離心收集上清蛋白。行凝膠電泳，至酚溴藍(lán)染色接近膠底邊后停止電泳。電泳后將凝膠中的蛋白質(zhì)通過濕法電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將封閉轉(zhuǎn)移后的PVDF，分別加入按適當(dāng)比例稀釋的一抗(兔抗人Bmi單克隆抗體、鼠抗人SMO單克隆抗體、兔抗人Notch-1單克隆抗體、鼠抗人Oct3/4單克隆抗體或鼠抗人β-catenin單克隆抗體)；4℃過夜或37℃搖床2～3 h。去掉一抗，加入二抗。常規(guī)曝光、顯影、定影和分析。采用Image J圖像軟件對目的蛋白條帶的光密度值，以β-actin蛋白的光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算各目的蛋白與內(nèi)參照的相對吸光度值作為其表達(dá)的相對含量。

1.7裸鼠皮下接種成瘤實(shí)驗(yàn) 取6只4～6周齡Balb/C裸鼠，并將其隨機(jī)分為3組。分別按梯度將1×103、1×104及1×105個(gè)CD133+和CD133-細(xì)胞接種于9只裸鼠前肢兩側(cè)背部皮下。4 w后用頸椎脫臼法處死裸鼠，切下皮下移植瘤，測量其大小，并計(jì)算其體積。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MHCC97H分選前后CD133的表達(dá) CD133在分選前的MHCC97H細(xì)胞株中呈低表達(dá)(1.09±0.43)%；CD133在分選后的CD133+細(xì)胞亞群中呈高表達(dá)(86.65±6.49)%。分選前后CD133的表達(dá)差異顯著(P<0.01)。

2.2免疫組化法檢測CD133在不同細(xì)胞中的表達(dá) CD133在細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色均勻染色。在未分選的MHCC97H細(xì)胞株中胞膜及胞質(zhì)中偶見棕黃色顆粒，即CD133表達(dá)較弱；在分選后CD133+細(xì)胞亞群中胞膜及胞質(zhì)中可以看到大量的棕黃色顆粒，即CD133表達(dá)較強(qiáng)；在分選后CD133-細(xì)胞亞群及陰性對照組中胞膜及胞質(zhì)中未見棕黃色顆粒，即CD133不表達(dá)。經(jīng)過檢測，未分選MHCC97H細(xì)胞組的灰度值為186.37±21.23，分選后CD133+細(xì)胞組的灰度值為156.42±16.58，CD133在分選后表達(dá)升高(P<0.01)。見圖1。

未分選 分選后CD133+

2.3細(xì)胞體外增殖能力的比較結(jié)果 CD133+細(xì)胞的OD 490 nm值要高于CD133-細(xì)胞和未分選MHCC97H細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。從三組細(xì)胞的生長曲線圖可以看出，CD133+細(xì)胞組的曲線較陡直；未分選MHCC97H細(xì)胞組次之，生長曲線稍平緩；而CD133-細(xì)胞的生長曲線較為平坦。見表2。

表1 細(xì)胞體外增殖能力比較±s，n=30)

2.4不同細(xì)胞體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將不同數(shù)量級的CD133+細(xì)胞與CD133-細(xì)胞分別各接種到3只裸鼠皮下。第3天時(shí)CD133+細(xì)胞組已有部分接種部位長出移植瘤，直到第4周CD133-細(xì)胞組才有1個(gè)接種部位有移植瘤形成。CD133+細(xì)胞組共有7個(gè)接種部位有移植瘤形成，而CD133-組只有1個(gè)接種部位有移植瘤形成。此外，CD133+細(xì)胞組形成的移植瘤體積、重量及數(shù)量均與CD133-細(xì)胞大。見表2。

2.5Western印跡法檢測結(jié)果 Bmi、SMO、Notch-1、Oct3/4和β-catenin蛋白在CD133+細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng)，而在CD133-細(xì)胞中則表達(dá)較弱(圖2)。分別將Bmi,SMO,Notch-1,Oct3/4和β-catenin蛋白條帶光密度與其相應(yīng)的β-actin的光密度進(jìn)行比，然后再將其比值分別進(jìn)行比較，CD133+細(xì)胞與CD133-細(xì)胞之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

圖2 Western印跡檢測不同細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)

表2 CD133+和CD133-細(xì)胞成瘤的數(shù)量及大小

表3 不同細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)±s,n=30)

3 討 論

近年來研究表明，腫瘤是由一小部分具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞驅(qū)動下發(fā)生的。它不僅是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵，而且還是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的源泉〔1～5〕。隨著對腫瘤認(rèn)識觀念的改變，對腫瘤的治療也必須從一個(gè)新的視角去把握。轉(zhuǎn)變過去針對大部分增殖能力有限的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療的模式，針對腫瘤干細(xì)胞治療消滅腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的根源，進(jìn)而有可能治愈腫瘤〔6～8〕。

本研究中采用MACS技術(shù)對MHCC97H細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞亞群進(jìn)行分離，然后再用流式細(xì)胞儀檢測分離純度及分選效果〔2〕。本研究結(jié)果提示MACS是一個(gè)非常理想的分離純化肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的方法。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞免疫組化檢測結(jié)果顯示，與FACS定量分析結(jié)果基本吻合。在MHCC97H細(xì)胞株中只有(1.09±0.43)%的細(xì)胞恒定表達(dá)膜抗原CD133，這說明CD133+細(xì)胞只是人肝癌細(xì)胞株MHCC97H中含量非常少的一個(gè)亞群。

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長曲線結(jié)果，提示CD133+細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的體外增殖能力，符合其作為腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

目前還不能從形態(tài)學(xué)上對腫瘤干細(xì)胞做出明確鑒定，只有從功能學(xué)方面對其進(jìn)行鑒定〔2～4〕。雖然體外培養(yǎng)可一定程度上反映腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，但最終還需要通過體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)其致瘤性。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)是將分離純化的特定細(xì)胞亞群接種到裸鼠內(nèi)，通過觀察接種后是否可形成移植瘤、移植瘤體積大小以及移植瘤形成所需要的時(shí)間等來綜合判斷其致瘤能力〔7～9〕。本研究結(jié)果表明：CD133+細(xì)胞亞群的體內(nèi)成瘤能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CD133-細(xì)胞亞群，這也表明CD133+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。隨后將移植瘤切除，制成病理切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。病理觀察可見，移植瘤與人原發(fā)肝癌在病理形態(tài)上非常相似。這些結(jié)果表明CD133+細(xì)胞亞群在裸鼠體內(nèi)增殖分化產(chǎn)生了移植瘤內(nèi)其他細(xì)胞，也證實(shí)了它具有較強(qiáng)的增殖分化潛能。因此，本研究認(rèn)為CD133是人肝癌細(xì)胞株MHCC97H的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志之一。

近年來研究表明，腫瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞具有很多相似的生物學(xué)特性，這可能與它們具有某些相同的干細(xì)胞自我更新、增殖和分化調(diào)控基因有關(guān)〔7〕。本研究Western印跡檢測結(jié)果提示CD133+細(xì)胞亞群高表達(dá)這些與干細(xì)胞/前體細(xì)胞增殖、自我更新以及決定其特性密切相關(guān)的基因，進(jìn)而證實(shí)CD133+細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。

綜上所述，本研究證實(shí)肝癌MHCC97H細(xì)胞中存在CD133+細(xì)胞亞群，其增殖、多向分和成瘤性均高于CD133-細(xì)胞亞群，并且高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因，如：Bmi,Hedgehog/SMO,Notch-1,Oct3/4,Wnt/β-catenin等。因此，本研究認(rèn)為CD133+細(xì)胞可能富集了腫瘤干細(xì)胞，從而為肝癌今后的治療提供一種新方法和新思路。

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