葛根素對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響

廉 皓，殷 濤 (赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院普外二科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

在肝外科臨床實踐中，常需阻斷入肝血流以完成復(fù)雜的手術(shù)，如行肝破裂修補(bǔ)術(shù)、肝部分切除術(shù)等，當(dāng)血供恢復(fù)后，再灌注對肝細(xì)胞的損傷更加嚴(yán)重，即所謂的HIR［1］。最近的研究表明，中性粒細(xì)胞、細(xì)胞因子等在HIR中起到了重要作用［2］。本實驗通過建立大鼠HIR模型，用葛根素注射液經(jīng)大鼠尾靜脈注入，來觀察葛根素對大鼠HIR的防治效果，進(jìn)而探討葛根素對大鼠HIR的保護(hù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物:清潔級健康雄性SD大鼠80只(由赤峰學(xué)院實驗動物中心提供)，體重200～250 g，隨機(jī)分為Sham、IR、IP、Pue組，再按再灌注1 h、3 h、6 h、24 h 分成4 個時相，每組各時相為5只。

1.2 主要試劑:葛根素注射液(2 ml∶100 mg)為廣東燕塘生物化學(xué)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號:0112111。生化試劑盒MDA、SOD購于南京建成生物工程研究所。免疫組化試劑盒TNF-α、IL-6購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備:按Nauta等［3］法制作HIR模型，即入腹后顯露第一肝門部，分離膽管及門靜脈、肝動脈分支，用無創(chuàng)動脈夾夾閉肝左葉及中葉血流，造成70%肝臟缺血，但不影響門靜脈血液回流，防止門靜脈和胃腸道淤血，40 min后移走動脈夾恢復(fù)血流。

1.3.2 標(biāo)本取材和收集:各組分別在再灌注1 h、3 h、6 h、24 h對5只大鼠采血，3 000 r/min離心30min，提取血清，置-20℃冰箱待測;上述4個時間點每組各取1只大鼠的左肝固定部分組織，立即置于3%戊二醛中固定。

1.3.3 實驗指標(biāo)檢測

1.3.3.1 肝臟生化指標(biāo):取血清1 ml，利用全自動化生化分析儀，檢測血清ALT水平。血清MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法、SOD采用黃嘌呤氧化酶法。

1.3.3.2 免疫組化染色及結(jié)果判定:按照 TNF-α、IL-6免疫組化試劑盒SP法染色步驟操作。

TNF-α、IL-6的陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。采用光學(xué)顯微鏡下分別計數(shù)陽性細(xì)胞率。

1.3.3.3 透射電鏡檢查:取出固定的肝組織，修成數(shù)個0．1 cm3組織塊，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次(每次10 min)，置于1%鋨酸中固定，梯度酒精脫水，浸透，包埋，電鏡觀察。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析:利用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，SNK法進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 肝臟酶學(xué)檢測結(jié)果:IR、IP及Pue組肝缺血后再灌注各個時相的血清 ALT、MDA水平均明顯高于 Sham組(P＜0．01)。與IR組相比，IP和 Pue組各個時間點的值(P＜0．01)。與IP組相比，Pue組各個時間點的值(P＜0．05)。另外，IR、IP及Pue組ALT、MDA在再灌注后6 h升高到最高(P＜0．05)。而SOD則在IR、IP和Pue組肝缺血后再灌注各個時相明顯低于Sham組(P＜0．01)。與IR組相比，IP和Pue組各個時相點的值(P＜0．01)。與IP組相比，Pue組SOD各個時相點的值(P＜0．05)。見表1、表2。

表1 各組血清ALT及MDA濃度變化(x ±s，U/L)

表2 各組肝組織SOD濃度(x ±s，NU/L)

2.2 再灌注后TNF-α、IL-6的表達(dá):表3為TNF-α及IL-6表達(dá)情況:與Sham組相比，IR、IP及Pue組在肝缺血后再灌注后各個時間點的表達(dá)均明顯增加(P＜0．01);與IR組相比，IP及Pue組的表達(dá)均明顯減少(P＜0．05);與IP組相比，Pue組的表達(dá)均明顯減少(P＜0．05)。

2.3 透射電鏡下觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化:再灌注6 h后，電鏡下行肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，見圖1～4。

Sham組細(xì)胞核核膜結(jié)構(gòu)清楚，無固縮，胞漿內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體形態(tài)正常，排列規(guī)則;IR組線粒體腫脹明顯，伴擴(kuò)張，嵴變形、斷裂，部分細(xì)胞核核膜消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，其上的核蛋白體脫落;IP組線粒體輕微腫脹，無明顯擴(kuò)張，核膜結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張，排列較規(guī)則;Pue組僅有少量線粒體略腫脹，偶有輕微擴(kuò)張，核膜結(jié)構(gòu)清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略輕度擴(kuò)張，排列很規(guī)則。

表3 各組肝組織TNF-α及IL-6的表達(dá)(x ±s，%)

圖1 各組肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(12 000)

3 討論

HIR是多細(xì)胞參與的病理生理過程。先前研究認(rèn)為HIR主要是氧自由基及脂質(zhì)過氧化對肝臟造成損傷，近些年認(rèn)為是一個全身炎癥反應(yīng)過程［4］。本研究中大鼠肝缺血再灌注對肝臟造成了嚴(yán)重?fù)p傷，以再灌注6 h為著，表現(xiàn)為生化指標(biāo)明顯升高，以及炎癥因子TNF-α、IL-6的陽性表達(dá)，同時肝細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)改變。通過本實驗得出，Pue與IP組通過消除氧自由基、脂質(zhì)過氧化，下調(diào)炎癥因子共同作用對HIR肝臟的保護(hù)，且Pue組效果要更好(P＜0．05)，具體闡述如下。

HIR時，機(jī)體通過多種途徑產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。而SOD及MDA是目前公認(rèn)的反映機(jī)體氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化損傷程度的間接指標(biāo)［5］。本實驗顯示:HIR期間，血漿 SOD活性顯著下降，而MDA水平明顯升高;自由基啟動脂質(zhì)過氧化過程中生成的脂質(zhì)過氧化物，使肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，最終引起肝細(xì)胞的損傷、壞死、凋亡。

缺血再灌注損傷主要是中性粒細(xì)胞(PMN)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，激活的PMN在細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)的引導(dǎo)下，釋放大量化學(xué)介質(zhì)，造成肝組織損傷。TNF-α在這一過程中參與細(xì)胞的損傷，研究表明［6］:在HIR期間肝臟KC細(xì)胞分泌大量TNF，過量TNF誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝臟損傷。本研究中，缺血再灌注后TNF-α在肝組織中的表達(dá)隨再灌注時間延長而逐漸升高。與IR組相比，IP和Pue組低于IR(P＜0．05);Pue組低于IP組(P＜0．05)。IP作為一種公認(rèn)的對HIR的保護(hù)作用已有文獻(xiàn)報道［7］。IP后血液TNF-α水平的上升受到抑制，推斷其對肝臟的保護(hù)效應(yīng)可能與下調(diào)TNF-α水平有關(guān)，這也提示Pue的保護(hù)效應(yīng)也可能是通過下調(diào)TNF-α水平對HIR起到很好的保護(hù)作用。IL-6主要來源于單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥、免疫調(diào)節(jié)等過程。而肝臟是合成和清除IL-6的重要場所。HIR時IL-6水平顯著升高，有研究證實［8］，IL-6可激活KC細(xì)胞分泌更多的細(xì)胞因子，還可顯著地降低PMN的自然凋亡率，進(jìn)而加重了炎癥反應(yīng)程度。實驗表明，IR組較Pue及IP組IL-6明顯升高(P＜0．05)，而 Pue組較 IP組更低(P＜0．05)，可以得出葛根素及IP都可減少IL-6的形成，而葛根素抗炎效果要比IP好。

葛根素具有抗自由基損傷、抑制血小板活化與聚集等藥理作用，筆者認(rèn)為，在肝缺血早期葛根素通過清除氧自由基及減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，尤其是通過下調(diào)TNF-α、IL-6水平來削弱PMN在HIR過程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，來改善肝細(xì)胞缺氧狀態(tài)，同時降低了PMN激活率，從而減少了大量炎性因子的產(chǎn)生。

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