慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血及支氣管肺泡灌洗液中CCR6、CCR7的變化及意義

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州 遵義 563099

慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血及支氣管肺泡灌洗液中CCR6、CCR7的變化及意義

孫得勝歐陽(yáng)瑤顧延會(huì)

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州 遵義 563099

目的了解樹(shù)突狀細(xì)胞的趨化因子受體CCR6、CCR7在COPD大鼠外周血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的變化。方法選用20只健康Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、COPD模型組(10只)，采用兩次氣道內(nèi)注入細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)和連續(xù)被動(dòng)吸煙4周的方法建立COPD大鼠模型。第28天處死兩組大鼠。取大鼠肺臟組織用石蠟包埋HE染色以觀察肺組織病理學(xué)改變，酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)BALF及外周血中CCR6、CCR7的含量。結(jié)果COPD模型組大鼠一般狀況較正常對(duì)照組大鼠差，體重顯著減輕模型組(242.31±14.71)g，對(duì)照組(324.18±12.89)g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05)，HE染色提示慢性阻塞性肺疾病的特征性病理改變。BALF中CCR6含量在COPD模型組(105.81±2.73)ng/L明顯高于正常對(duì)照組(43.57±5.51)ng/L，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CCR7的含量在COPD模型組(10.40±3.07)ng/L低于正常對(duì)照組(41.73±7.40)ng/L，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組大鼠外周血中CCR6含量模型組(264.89±45.34)ng/L，對(duì)照組(311.12±29.78)ng/L、CCR7含量模型組(73.77±29.71)ng/L，對(duì)照組(56.42±15.30)ng/L均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論COPD大鼠肺組織病理符合人COPD特征性病理改變，提示COPD大鼠模型建立成功。樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體CCR6在COPD大鼠肺部明顯增多，而成熟樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子受體CCR7在COPD大鼠肺部減少。

慢性阻塞性肺疾??；CCR6；CCR7

現(xiàn)代研究認(rèn)為慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的發(fā)病與肺部對(duì)卷煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。導(dǎo)致這種炎癥發(fā)生的確切機(jī)制目前還不十分清楚，但已有研究證實(shí)在此過(guò)程中免疫細(xì)胞被募集到肺[2]。COPD中的免疫應(yīng)答至少部分地被特定的抗原所驅(qū)使[2-4]，這些免疫應(yīng)答過(guò)程在樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)的嚴(yán)密調(diào)控下完成[5-6]。氣道DC環(huán)繞氣道形成一個(gè)高度敏感的“哨兵式”網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，它們?cè)跉獾滥軓耐旰玫纳掀そM織移行到被外來(lái)抗原侵襲的地方[7]，受到信號(hào)刺激的DC表面受體介導(dǎo)了這一過(guò)程[8]。在攝取抗原之后，DC遷移到局部引流淋巴結(jié)，并把抗原信息提呈給特定的T淋巴細(xì)胞，這些T細(xì)胞組織了對(duì)抗外來(lái)抗原的炎癥反應(yīng)[5]。在遷移的過(guò)程中，DC上調(diào)了其細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)——這一過(guò)程也稱為DC的成熟[9]。DC的順利遷移是趨化作用的結(jié)果，它得益于DC趨化因子受體的表達(dá)[10]以及它們與相應(yīng)的趨化因子間的相互作用。

趨化因子 (chemokine)是一類能夠使細(xì)胞產(chǎn)生趨化運(yùn)動(dòng)的低分子量細(xì)胞因子，它們由不同類型的細(xì)胞所分泌，在正常和非正常生理狀態(tài)下都發(fā)揮著重要作用[11]，與機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系[12]。CCL20是未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞 ( immature DC, iDC ) 的主要趨化因子，在把iDC募集到上皮組織的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)的時(shí)候，在炎癥介質(zhì)的刺激作用下，表達(dá)于氣道上皮的CCL20大量增加[13-14]。趨化因子受體( chemokines receptors ) 是能夠特異性結(jié)合趨化因子的跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，通過(guò)與其配體的結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮著多種生物學(xué)作用[11]。CCR6是CCL20的唯一受體[13]，它們兩者之間的相互作用被認(rèn)為是 iDC被募集于氣道的一個(gè)可能的重要機(jī)制。CCR7是成熟DC ( mature DC, mDC )完成抗原提呈從而激活初始T細(xì)胞的主要受體[10]，在DC的遷移、歸巢中起著關(guān)鍵作用。CCR7在與其配體CCL19、CCL21的作用下[11]，引導(dǎo)mDC遷移至淋巴結(jié)。

本研究通過(guò)卷煙煙霧刺激和向大鼠氣道內(nèi)注入少量LPS制備大鼠COPD模型，觀察CCR6、CCR7在大鼠外周血和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的含量，探討DC趨化因子受體在COPD發(fā)病中的表達(dá)變化和意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和材料 20只健康雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g。購(gòu)買(mǎi)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為：[SCXK(渝)2007-0005]。脂多糖(E.coli 055:B5，美國(guó)Sigma公司)，大鼠趨化因子受體6 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，大鼠趨化因子受體7 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，卷煙(黃果樹(shù)牌，煙氣煙堿量1.0mg焦油含量11mg 貴州中煙工業(yè)有限公司)。

1.2 模型制備 把20只大鼠隨機(jī)分為兩組：正常組(10只)、COPD組(10只)。參考宋一平等的方法并在此基礎(chǔ)上略作改進(jìn)制作大鼠COPD模型[15]：模型組大鼠于第1、15d氣道內(nèi)注入200μg/200μL LPS溶液；第2～28d(第15d除外)于自制熏煙箱(由有機(jī)玻璃制成，30cm×40cm×90cm，箱頂端有直徑1.5cm大小的圓形通氣孔，箱中央自下往上設(shè)有兩排鐵絲網(wǎng)，兩排鐵絲網(wǎng)之間的箱子底部放置卷煙)內(nèi)被動(dòng)吸煙30 min×12支/次，2次/d，每日2次被動(dòng)吸煙造模操作之間間隔2 h，使其呼吸新鮮空氣。正常組不予特殊處理，呼吸新鮮空氣。飼養(yǎng)方法與對(duì)照組相同。模型組大鼠注LPS的當(dāng)天給予正常飼養(yǎng)，使其呼吸新鮮空氣，不予被動(dòng)吸煙。

1.3 標(biāo)本采集 第28 天分別選取正常對(duì)照組、COPD模型組大鼠在其清醒的狀態(tài)下，用直徑1mm的毛細(xì)吸管穿刺內(nèi)毗球后靜脈叢血管，采集血液1ml，用于ELISA檢查。腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/100g)麻醉，大鼠麻醉成功后仰臥位固定于事先備好的大鼠固定板上，手術(shù)開(kāi)腹，充分暴露腹腔，用采血針穿刺腹主動(dòng)脈并連接負(fù)壓采血管放血處死大鼠。同時(shí)開(kāi)胸，迅速結(jié)扎右側(cè)肺，剪取右側(cè)肺下葉肺組織約1cm×1cm×1cm大小，立即置于4%多聚甲醛中固定(固定時(shí)間不超過(guò)24 h)，以備用于石蠟標(biāo)本及病理切片的制作，并利于下一步進(jìn)行肺組織切片HE染色以及免疫組化實(shí)驗(yàn)。取右肺上葉標(biāo)本放入低溫冷凍管里，并立即放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。繼續(xù)手術(shù)充分暴露出大鼠的頸部氣管，在氣管的下段作一個(gè)倒“T”字形切口，由上向下以內(nèi)徑1mm大小的塑料管行氣管插管，緩緩注入5ml 4℃生理鹽水，輕輕按摩膨脹的肺臟約5min，回抽后再注入，如此反復(fù)灌洗3次(支氣管肺泡灌洗液總回收率>80%)，將回抽的灌洗液注入15ml的塑料離心管中(離心管置于冰盒里)，此即為BALF標(biāo)本，用于ELISA檢查。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 光學(xué)顯微鏡下觀察各HE染色的切片，使用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件IPWin32圖像采集系統(tǒng)對(duì)各HE切片進(jìn)行圖像采集。用ELISA法測(cè)定BALF及外周血中CCR6和CCR7的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示，兩組間樣本均數(shù)比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況的觀察 正常對(duì)照組的大鼠一般狀況比較好，活潑好動(dòng)，毛發(fā)的光澤度比較好，呼吸平穩(wěn)規(guī)則，體重增長(zhǎng)比較迅速。COPD模型組的大鼠毛發(fā)漸漸失去光澤，活動(dòng)減少，神情倦怠，體重增長(zhǎng)緩慢，第7d起出現(xiàn)倦怠、咳嗽以及呼吸幅度加深等表現(xiàn)，而且上述表現(xiàn)逐漸明顯、加重，在實(shí)驗(yàn)的后期稍微活動(dòng)即出現(xiàn)氣促等癥狀。第28天 COPD模型組大鼠體重(242.31±14.71)g，低于正常對(duì)照組(324.18±12.89)g，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 大鼠肺臟組織的大體標(biāo)本的肉眼觀察 正常對(duì)照組大鼠的肺臟組織無(wú)腫脹或出血，外觀有光澤，呈粉紅色。COPD模型組大鼠的肺組織明顯腫脹，亦未見(jiàn)出血或滲出物，但其表面可見(jiàn)囊泡狀突起，外觀光澤度較差，呈灰白色。

2.3 大鼠肺臟組織的病理學(xué)特點(diǎn) 正常對(duì)照組：光鏡下(見(jiàn)圖1)小支氣管未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體,肺泡壁完好，肺泡結(jié)構(gòu)完整連續(xù)。COPD模型組第28天：光鏡下(見(jiàn)圖2)見(jiàn)肺泡隔增寬，伴有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隔內(nèi)見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，部分肺泡隔變窄、斷裂并融合。

2.4 各組大鼠的外周血和BALF中CCR6的含量(ng/L) 用ELISA法分析兩組大鼠的外周血中CCR6的含量，結(jié)果顯示CCR6含量在COPD模型組中(264.89±45.34)與正常對(duì)照組(311.12±29.78)相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用ELISA法分析兩組大鼠的BALF中CCR6的含量，結(jié)果顯示CCR6含量在COPD模型組中(105.81±2.73)高于正常對(duì)照組(43.57±5.51)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 各組大鼠的外周血和BALF中CCR7的含量(ng/L) 用ELISA法分析兩組大鼠的外周血中CCR7的含量，結(jié)果顯示CCR7含量在COPD模型組中(73.77±29.71)與正常對(duì)照組(56.42±15.30)相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用ELISA法分析兩組大鼠的BALF中CCR7的含量，結(jié)果顯示CCR7含量在COPD模型組中(10.40±3.07)低于正常對(duì)照組(41.73±7.40)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠外周血及BALF中CCR6的含量(ng/L)

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.01。

表2 各組大鼠外周血及BALF中CCR7的含量

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.01。

3 討論

COPD是一種可防治的常見(jiàn)疾病，其特征為持續(xù)存在的氣流受限，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，伴有氣道和肺對(duì)有害顆粒或氣體所致慢性炎癥反應(yīng)增加[16]，其本質(zhì)是發(fā)生于氣道的慢性非特異性炎癥性疾病。研究人員在COPD的病灶里發(fā)現(xiàn)了DC的存在，并且還發(fā)現(xiàn)其數(shù)量和功能均發(fā)生了改變，這些發(fā)現(xiàn)提示了COPD的發(fā)病機(jī)制可能與DC有關(guān)。

現(xiàn)在認(rèn)為COPD的發(fā)病受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重作用。在環(huán)境因素里，吸煙和感染被大家認(rèn)為是最主要的兩個(gè)因素。我們以被動(dòng)吸煙和向大鼠的氣道內(nèi)注入LPS模擬這一病理過(guò)程建立大鼠COPD模型，28天后COPD模型組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)能力降低、毛發(fā)失去光澤、咳嗽以及呼吸道分泌物增加等，病理學(xué)檢查結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，符合COPD病理的典型表現(xiàn)，提示模型制備成功。

DC的功能和趨化因子介導(dǎo)的體內(nèi)遷移密切相關(guān)，藉著遷移使DC有效地把所捕獲的抗原提呈給初始T 細(xì)胞并使之活化和分化，進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答作用[10]。 在前言中我們已經(jīng)提到CCL20是iDC的主要趨化因子，在把iDC募集到上皮組織的過(guò)程中起重要的作用，已有研究顯示COPD患者氣道上皮的CCL20表達(dá)增加[14]。 CCL20是CCR6的配體，它們兩者之間的相互作用很可能是 iDC被募集到氣道的一個(gè)重要機(jī)制。

CCR7是成熟DC ( mature DC, mDC )完成抗原提呈從而激活初始T細(xì)胞的主要受體[10]，在DC的遷移、歸巢中起著關(guān)鍵作用。目前認(rèn)為外周的DC都是通過(guò)淋巴組織趨化因子作用于CCR7這條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)向淋巴組織遷移的[17]。

本研究使用ELISA的方法檢測(cè)各組大鼠的支氣管肺泡灌洗液(BALF)以及外周血中CCR6、CCR7的含量。

研究結(jié)果顯示， BALF中CCR6的含量在COPD模型組高于正常對(duì)照組(P<0.01)。而外周血中CCR6的含量沒(méi)有顯著的差異(P>0.05)。

多項(xiàng)研究表明COPD的發(fā)病可能與DC在肺臟局部的增多有關(guān)[18-19]，而這種增多極可能因外周血中的一部分iDC被趨化到肺臟。這一趨化過(guò)程的完成有賴于iDC的趨化因子CCL20和iDC的趨化因子受體CCR6的結(jié)合[14]。當(dāng)氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)的時(shí)候，在炎癥介質(zhì)的刺激下，表達(dá)于氣道上皮的CCL20大量增加[13]，故而在COPD者的肺臟局部CCL20也是明顯增加的，我們課題組前期的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)[20-22]。作為與DC緊密相連的CCR6可看做DC自身結(jié)構(gòu)的一部分，在肺臟局部大量CCL20的吸引下，血液中的部分CCR6帶動(dòng)iDC從它們的儲(chǔ)備庫(kù)外周血向肺組織遷移[23]，從而造成肺臟局部DC和CCR6的顯著增多。

BALF 測(cè)定結(jié)果顯示引導(dǎo)mDC向淋巴結(jié)遷移的CCR7的含量在COPD模型組低于正常對(duì)照組(P<0.01)。Bratke等的研究也得到類似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)與不吸煙者相比，吸煙者BALF中CCR7呈低表達(dá)，并且其表達(dá)程度與氣道受限的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[24]。

本實(shí)驗(yàn)中兩組大鼠外周血中CCR6、CCR7的含量均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，可能是因?yàn)樵诜闻K局部發(fā)生變化的這部分DC的數(shù)量與外周血中的DC的總量相比，常常顯得微乎其微。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提示COPD模型組大鼠血液中部分iDC可能在CCR6作用下，被趨化到肺，造成模型組大鼠肺部DC增多。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)COPD模型組的大鼠肺臟局部mDC的趨化因子受體CCR7減少，這提示COPD的發(fā)病也可能與肺臟局部mDC在CCR7的引導(dǎo)下向局部引流淋巴結(jié)遷移有關(guān)，但這兩者間的關(guān)聯(lián)性尚需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

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ExpressionsofCCR6andCCR7inperipheralbloodandBALFofratswithCOPD

SUN De-sheng, OU Yang-yao, GU Yan-hui

Department of Respiratory Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou 563099, China

ObjectiveTo investigate expressions of CCR6 and CCR7 in peripheral blood and BALF of rats with COPD.Methods20 Wistar rats were randomized into normal control group and COPD model group. COPD was induced by established cigarette smoke inhalation about four weeks and intratracheal 200μg/200μL of LPS solution twice totally. All animals were killed at the 28th day. Then pathomorphology of rats’ lung and bronchiole were investigated by HE staining. The contents of CCR6 and CCR7 in the BALF were analyzed with ELISA, so were those in the peripheral blood.ResultsRats in the COPD model group expressed lassitude and less activity, and their weight was lower than the normal control group with a significant difference(P<0.05). The HE staining result suggest that the changes of pathology of the COPD model at 28-day were the same as those of COPD patients. The contents of CCR6 and CCR7 in rats’ peripheral blood were not significantly different between the two groups. The content of CCR6 in BALF about the COPD model group was significantly increased compared with the controls (P<0.01). The content of CCR7 in BALF about the COPD model group was significantly reduced compared with the controls (P<0.01).ConclusionThe COPD rats model was established successfully by this combined methods. The expressions of CCR6 are increased in the lungs of rats with COPD, but those of CCR7 are decreased.

COPD;CCR6; CCR7

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(NO：黔省專合字[2008]62號(hào))。

歐陽(yáng)瑤，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：COPD的發(fā)病機(jī)制，E-mail：ouyangyao116@sohu.com。

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1007-8517(2014)13-0056-03

2014.05.04)