SD大鼠大椎穴BDA神經(jīng)通路示蹤研究

云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500

SD大鼠大椎穴BDA神經(jīng)通路示蹤研究

和鳳軍唐柱生吳冠儒陳學秋李啟勇宋波郝敬紅黃利民

云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500

目的探討大椎穴神經(jīng)傳導通路及其與周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路有無差異，為針刺大椎穴治療疾病機理與神經(jīng)調(diào)節(jié)的相關(guān)性提供形態(tài)學依據(jù)。方法將12只SD大鼠分成實驗組和對照組，每組6只。大椎穴組(實驗組)和第6～7頸椎棘突間組(對照組)分別于大椎穴和第6、7頸椎棘突之間注射15%BDA，10μl/只，所有實驗大鼠注射后存活7天，行灌注固定取腦和脊髓，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖-0.1M PBS液沉底，取脊髓C1-C4和腦干行片厚10μm冰凍切片，免疫組化反應，DAB顯色，觀察各組腦干和脊髓內(nèi)陽性細胞的分布特點和差異。結(jié)果BDA陽性細胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質(zhì)和突起染色深。在脊髓C1-C4節(jié)段灰質(zhì)前角、后角、灰質(zhì)聯(lián)合、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均可見到數(shù)量不等、大小不一的陽性細胞，其中實驗組各部的陽性細胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統(tǒng)計學意義；中腦內(nèi)紅核和中央尾葉核均可見陽性細胞，其中實驗組陽性細胞明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論BDA可以跨神經(jīng)元逆行轉(zhuǎn)運，是穴位神經(jīng)通路示蹤的可靠神經(jīng)示蹤劑；大椎穴及其周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路在脊髓上頸節(jié)段和中腦傳導路徑相似，但是各部的陽性細胞數(shù)量有差異，實驗組陽性細胞明顯多于對照組，其機理和詳細神經(jīng)通路有待進一步深入研究。

SD大鼠；大椎穴；神經(jīng)通路示蹤；BDA

大椎穴是中醫(yī)臨床常用的穴位,可用于治療感冒、哮喘、發(fā)熱、失眠、椎-基底動脈供血不足、頸椎病、痤瘡、帶狀皰疹、白細胞減少癥、急性扁桃體炎、咽炎、糖尿病性周圍神經(jīng)病變、高血壓等[1]，是治療疾病、保健養(yǎng)生的要穴。但是，針刺或艾灸大椎穴治療以上疾病的具體機理還不完全清楚。目前普遍認為神經(jīng)系統(tǒng)-免疫系統(tǒng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)之間存在相互調(diào)節(jié)，相互影響，共同構(gòu)成人體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。本研究通過用生物素葡聚糖胺(Biotinylated-dextran amine，BDA)對SD大鼠大椎穴神經(jīng)通路進行示蹤，以期探討該穴位區(qū)與中樞神經(jīng)之間的神經(jīng)通路聯(lián)系，這將有助于從神經(jīng)調(diào)節(jié)角度探討針刺或艾灸大椎穴治療疾病的機理，為闡明針刺大椎穴治療疾病的相關(guān)機理提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 SD大鼠12只 雌雄各6只，四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，許可證號(合格證號)SCKK(川)2004-16，SCXK(川)2005-00010Q。分為大椎穴組(實驗組)和第6～7頸椎棘突間組(對照組)兩組，每組各6只。

1.2 注射方法 按林文注[2]大鼠大椎穴“在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中”定位，25%烏拉坦按0.3ml/100g體重腹腔注射麻醉，以隆椎為體表標志，剪去項背部正中皮毛，定位清楚后實驗組在大椎穴注射15%BDA，10μl/只，與棘突間平行進針，深度約5mm，注射完后留針10min；對照組于項部正中，第6～7頸椎棘突間注射15%BDA，10μl/只，與棘突間平行進針，深度約5mm，注射完后留針10min。兩組實驗大鼠注射神經(jīng)示蹤劑后籠養(yǎng)存活7天。

1.3 試劑及儀器 神經(jīng)示蹤劑Neuro Trace TM BDA-10,000 Neuronal Tracer Kit，U.S.A. 含：①10，000Mw BDA(A劑)，凍干BDA 3mg/瓶×6瓶，②avidin-HRP(B劑)，凍干avidin-HRP 100μg/瓶×6瓶，③DAB(C劑)，250mg/瓶×1瓶。于-200C～-800C冰箱干燥避光保存，購自北京中杉金橋；DAB顯色試劑盒(20×)3ml,ABC各3ml，A濃縮緩沖液，B濃縮DAB溶液，C濃縮過氧化氫溶液；烏拉坦(氨基甲酸乙酯，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn))；PBS磷酸鹽緩沖液ZLI-9062 2000ml/袋(0.01M PH 7.2～7.4)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；France Millipore 超純水系統(tǒng)；Leica CM 1900冰凍切片機；Motic BA310-Moticam Pro282A病理圖像分析系統(tǒng)。

1.4 灌注取材 大鼠稱重，按25%烏拉坦0.3ml/100g體重腹腔注射麻醉，仰臥位將大鼠四肢和頭部固定在自制大鼠固定板上，從上腹部剪開皮膚至頸部，向兩側(cè)分離皮膚暴露胸部肌肉，從劍突兩側(cè)依次向嘴側(cè)剪開膈、肋和肋間肌，向嘴側(cè)翻起胸骨及其連帶組織，充分暴露胸腺、心包和肺。將輸液針從心尖刺入插至升主動脈，先灌注生理鹽水約130ml，剪開右心房排血至流出清亮液體，再灌注4%多聚甲醛約250ml至大鼠四肢和尾巴堅硬為止。將固定好的大鼠取俯臥位固定，從后正中線由尾側(cè)向嘴側(cè)剪開皮膚并向兩側(cè)分離，從棘突兩側(cè)切開分離肌肉充分暴露脊柱棘突、肋、枕骨、顱頂骨，從第四腰椎棘突平面始，用小止血鉗咬開棘突、椎板暴露椎管和馬尾，用細頭止血鉗輕輕插入椎管由橫突水平從尾側(cè)到頭側(cè)方向夾除椎弓板及橫突顯露脊髓，在頭部正中用手術(shù)刀背沿正中線劃數(shù)下，用剪子輕鉆一個小洞，從小洞用止血鉗向兩側(cè)撐開顱骨暴露腦，用止血鉗夾除延髓和脊髓交界處枕骨充分暴露腦和脊髓，從尾側(cè)提起脊髓，剪除兩側(cè)前后根絲等脊髓與椎管間的連結(jié)組織、剪除與腦相連的腦神經(jīng)根，將腦和脊髓一起取出置入4%多聚甲醛中存儲。

1.5 切片及染色 取腦干和上頸段C1-C4脊髓30%蔗糖沉底，行片厚10μm冰凍切片。0.01MPBS液漂洗切片3次，10min/次→切片入1.0μg/ml Avidin-HRP液中，40C冰箱濕盒過夜→PBS液漂洗切片3次，10min/次→0.003%DAB顯色時間3～5 min，有反應后用蒸餾水終止DAB顯色→梯度上行酒精脫水(70%Alc→80%Alc→90%Alc→95%Alc→100%AlcⅠ→100%AlcⅡ，5～10min/次)→二甲苯透明(二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，5～10min/次)→中性樹膠封片。

1.6 觀察分析 在顯微鏡下，觀察腦干和脊髓上頸段切片中陽性細胞和陽性纖維的分布情況。Motic 病理圖像分析系統(tǒng)下拍片。兩組大鼠腦干和脊髓上頸段切片分別各取40片，在×200倍顯微鏡下計數(shù)陽性細胞。

2 結(jié)果

BDA陽性細胞呈棕黃色，胞核淡染，胞質(zhì)和突起染色深。在兩組大鼠脊髓C1-C4節(jié)段灰質(zhì)前角、后角、灰質(zhì)連合、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均可見到數(shù)量不等、大小不一的陽性細胞(見圖①-⑧)，其中實驗組各部的陽性細胞均多于對照組，組間比較差異明顯有統(tǒng)計學意義(具體見表1)。

灰質(zhì)前角(個)灰質(zhì)后角(個)灰質(zhì)連合(個)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(個)實驗組35±6 60☆28 1±1 87☆17 4±2 03☆16 8±2 30☆對照組29 6±1 2718 6±2 8813 4±1 5812 9±0 99

注：與對照組比較，☆P<0.05。

脊髓前角可見大、中、小陽性細胞，大細胞多見于前角尖，后角可見少量小陽性細胞，背外側(cè)索見密集纖維。中央管前后灰質(zhì)連合見大量中、小陽性細胞，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)見中多個小細胞，胞核淡染，細胞呈梭形或多角形，可見明顯的突起。

中腦內(nèi)紅核和中央尾葉核均可見陽性細胞(見圖a-d)，其中實驗組陽性細胞明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

BDA是一種與生物素結(jié)合的多聚葡萄糖胺，可用于順行和逆行示蹤，由Glover等[3]于1986年首次成功地運用在神經(jīng)束路追蹤中。陳亞亮[4]等應用BDA法成功地顯示了大鼠脊髓小腦束、前庭束纖維在小腦中央核及前庭核中的投射。

本次實驗采用BDA進行大椎穴及其周圍非穴位區(qū)神經(jīng)通路示蹤，兩組均于脊髓和腦干清楚顯示了BDA陽性細胞，提示BDA是穴位神經(jīng)通路示蹤的可靠示蹤劑，可以逆行跨神經(jīng)元示蹤；且實驗組的陽性細胞明顯多于對照組，可能與大椎穴處感受器、運動神經(jīng)末梢比非穴位區(qū)密集有關(guān)，提示大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)有一定的相關(guān)性。鑒于本次研究資料有限，大椎穴與延髓、腦橋、脊神經(jīng)節(jié)、頸交感神經(jīng)節(jié)、小腦、下丘腦等的神經(jīng)通路聯(lián)系還有待進一步研究。大椎穴左、右旁開處、第7頸椎與第1胸椎棘突間與大椎穴神經(jīng)通路有無差異還需要進一步探討。相信隨著研究的深入，項目組可以闡明大椎穴與中樞神經(jīng)聯(lián)系的神經(jīng)通路，為大椎穴治療疾病與神經(jīng)調(diào)節(jié)相關(guān)性提供形態(tài)學依據(jù)。

[1]翟景慧,李曉泓,李輝,等.近年大椎穴臨床研究概況. 北京中醫(yī),2004, 23(3):186-188.

[2]林文注，王佩.實驗針灸學.上海科學技術(shù)出版社,1999，9：288.

[3]Glover J C, Petursdottir G, Jansen J K S. Fluorescent dextran-amines as neuronal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Method, 1986,18:243～254.

[4]陳亞亮,李 莉,高秀來. BDA法神經(jīng)束路追蹤技術(shù). 首都醫(yī)科大學學報,2002,23(3):258-260.

云南省教育廳科學研究基金項目(立項)資助，項目編號：06Y318C。

和鳳軍(1970-)，男，納西族，醫(yī)學碩士，副教授，主要從事解剖、組胚學教學與科研。

R33-33

A

1007-8517(2014)13-0038-02

2014.05.08)