辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg 的影響

1.桂林市中醫(yī)院，廣西 桂林 530001；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004

辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的影響

李明1劉笑甫2張可鋒2

1.桂林市中醫(yī)院，廣西 桂林 530001；2.桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004

目的研究辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞分泌乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 和乙型肝炎e抗原(HBeAg) 的影響。方法采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；采用藥物不同濃度處理HepG2.2.15細(xì)胞72h后，以酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELISA 法)測定細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌水平。結(jié)果辣蓼醇提液濃度為1.8、0.9mg/ml時，對細(xì)胞有明顯毒性；濃度為0.6、0.3、0.1 mg/ml的辣蓼醇提液處理HepG2.2.15細(xì)胞株72h后，對 HBsAg、HBeAg 的分泌有抑制作用(P<0.05)，并呈量效關(guān)系。結(jié)論辣蓼醇提液具有體外抗HBV的作用，同時有一定毒性。

辣蓼；HepG2.2.15；HBsAg；HBeAg

辣蓼為蓼屬植物辣蓼PolygonumflaccidumMeism.，以全草入藥。其具有祛風(fēng)利濕，散瘀止痛，解毒消腫，殺蟲止癢的作用。臨床用于痢疾、胃腸炎、腹瀉、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打腫痛、功能性子宮出血；外用治療毒蛇咬傷、皮膚濕疹等[1]。辣蓼藥材資源豐富，我國西南各省均產(chǎn)，為民間常用防治肝炎的中草藥之一。本實驗通過觀察辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)一步開發(fā)高效、價廉、療效確切的治療肝臟疾病的藥物提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 辣蓼藥材2008年秋季采于廣西南寧高峰林場，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院韋松基教授鑒定，為蓼科植物辣蓼PolygonumPerfoliatumL. 的全草。樣品低溫干燥后，粉碎成粗粉，備用。

1.1.2 試劑 PBS磷酸緩沖鹽(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：09030901)；胰蛋白酶1∶250(美國Amresco，批號：351813039)；PPM1 培養(yǎng)液(美國GIBCO，批號：810815)；MTT(美國Amresco，進(jìn)口分裝)；二甲基亞砜 (美國Sigma，批號: 20080329)；乙型肝炎病毒表面抗原、核心抗原ELISA試劑盒(均購自上?？迫A生物技術(shù)有限公司，批號分別為20080320；20081030)。

1.1.3 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞2.2.15細(xì)胞系(簡稱HepG 2.2.15細(xì)胞)，購于美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心，再自行傳代培養(yǎng)。

1.1.4 儀器 AUW220D電子天平(日本島津公司)；303-0型電熱溫培養(yǎng)箱(濟(jì)南云成儀器有限公司)；SW-CJ-1FDA型超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán))；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；TS100-F型倒置顯微鏡(日本NIKON公司)；ELX800型全自動酶標(biāo)儀(美國 BIO-Tek公司)。

1.2 方法

1.2.1 辣蓼醇提液的提取與配制 將稱取的辣蓼藥材粉末10.0g倒入250mL圓底燒瓶中，加入100mL 70%乙醇水浴連續(xù)回流提取2次，每次1h，將回流液合并，濾過，得到提取液。將提取液于60 ℃揮干提取溶劑。以適量二甲基亞砜助溶，配成濃度為0.67g/ml的藥液，0.22 μm無菌微孔濾器濾過，然后將濾過后的無菌藥液用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液配成濃度為0.5、1.5、2.5、4.5、9、18 mg/ml的藥液，置于4℃冰箱中保存待用。

1.2.2 磷酸鹽緩沖溶液PBS的配制 稱7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4和1.8g K2HPO4溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L，再經(jīng)高溫高壓(121℃，30min)滅菌后，保存于4℃冰箱中待用。

1.2.3 消化液的制備 稱取0.25g胰酶(sigma-aldrich)，加入到100ml PBS溶液中，攪拌混勻，避免出現(xiàn)泡沫(損壞蛋白)，過濾除菌，置于4℃冰箱中待用。

1.2.4 HepG2.2.15細(xì)胞株的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮容器中取出細(xì)胞株HepG2.2.15的凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其細(xì)胞株盡快融化；從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，并加入10倍以上的培養(yǎng)液，混勻，1000rpm/min離心5min，棄去上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，1～3d 更換培養(yǎng)液。細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，將細(xì)胞進(jìn)行傳代，吸棄原培養(yǎng)液，用0.25%的胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，再用完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞，按1∶3傳代。細(xì)胞再次長滿后，進(jìn)行消化，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.5 藥物對細(xì)胞毒性MTT實驗 加入辣蓼醇提液，使其終濃度分別為1.8、0.9、0.6、0.3、0.1、0.05mg/L，同時設(shè)細(xì)胞對照組。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。藥物處理72h后，加入濃度為5mg/ml的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄上清液，用PBS緩沖溶液清洗2次，每孔加入二甲基亞砜150μl，室溫振蕩10min。在490nm處測定吸光值(OD)，計算出藥物對細(xì)胞破壞率。

1.2.6 抗原抑制作用實驗 依據(jù)藥物毒性實驗的結(jié)果，將藥物濃度設(shè)為0.6、0.3、0.1、 0.05mg/mL，每個濃度做3個復(fù)孔，同時設(shè)細(xì)胞對照組。 待藥物作用72h后，酶標(biāo)吸取上清液置培養(yǎng)板上，-20 ℃冷凍備用。采用ELISA法檢測上清液中 HBsAg、HBeAg的表達(dá) ，計算辣蓼對抗原的抑制百分率。

2 結(jié)果

2.1 辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用 當(dāng)藥液濃度為1.8、0.9和0.6mg/mL時，對細(xì)胞的破壞率高達(dá)67.28% 、45.22%和27.55%，有明顯毒性；當(dāng)藥液濃度為、0.3、0.1、0.05 mg/ml時，破壞率分別為14.36%、12.91%和12.14%，毒性不明顯。

2.2 辣蓼醇提液對HepG2.2.15細(xì)胞 HBsAg、HBeAg 分泌的影響 實驗結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組比較，藥物處理HepG2.2.15細(xì)胞株72h后，辣蓼醇提液0.6、0.3、0.1mg/ml對HepG2.2.15細(xì)胞株的 HBsAg、HBeAg 的分泌有一定抑制作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并呈一定的量效關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 辣蓼醇提液對HepG2.2.15 細(xì)胞分泌 HBsAg、HBeAg的影響

注：與細(xì)胞對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

現(xiàn)代藥理實驗表明，蓼屬的植物體外對多種致病菌起到良好的抗菌作用，能對肝癌BEL-7404細(xì)胞株有殺傷作用，還能抑制乙型肝炎病毒DNA多聚酶、降解HBV-DNA[2,3]。然而，目前對其尚缺乏系統(tǒng)性和深入的藥理學(xué)方面的研究，不利于辣蓼的開發(fā)利用。本實驗結(jié)合現(xiàn)代研究技術(shù)和方法對辣蓼在抗乙肝病毒，保護(hù)肝臟等方面的運用提供了科學(xué)的闡釋。實驗結(jié)果顯示，辣蓼醇提液對 HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg 均有明顯抑制作用，呈一定的量效關(guān)系；但同時也具有一定的毒性，用藥時須注意劑量的控制。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草·第2卷.[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:666.

[2]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983, 65(122):55263.

[3]胡海濱.“耐藥菌株”中草藥篩選試驗的研究[J].廣東醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,1990,6(1):40.

EffectOfPolygonumPerfoliatumL.OnTheExpressionOfHBsAgAndHBeAgInHepG2.2.15Cells

LI Ming1LI Xiao-fu2ZHANG Ke-feng2

1.Guilin Traditional Chinese Medical Hospital, Guangxi Province, Guilin 541002, China;2.Guilin Medical University，Guangxi Province,Guilin 541004,China

ObjectiveTo research the effect ofPolygonumPerfoliatumL. on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells.MethodsThe cytotoxicity ofPolygonumPerfoliatumL. was detected by MTT colorimetric assay.Diffrenent concentrations ofPolygonumPerfoliatumL. acting on HepG2.2.15 cells for 72h, and HBsAg, HBeAg in the cells was detected by ELISA.ResultsThe alcohol extract ofPolygonumPerfoliatumL.(1.8 and 0.9mg/ml)has significant toxicity for cells. The alcohol extract ofPolygonumPerfoliatumL.( 0.6、0.3 and 0.1mg/ml) shows inhibit effect to HBsAg、HBeAg(P<0.05), and has dose-effect relationship.ConclusionAlcohol extract ofPolygonumPerfoliatumL. shows the anti-HBV effect in Vitro, but also toxic to HepG2.2.15 cells.

PolygonumPerfoliatumL.；HepG2.2.15；HBsAg；HBeAg

李明，男，藥理學(xué)碩士。

張可鋒，E-mail:xueshengcailiao@163.com。

R285.5

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1007-8517(2014)13-0002-02

2014.04.26)