醫(yī)院制劑血尿康膠囊質(zhì)量標準提升研究

1.貴州省遵義市第四人民醫(yī)院,貴州 遵義 563004;2.貴陽中醫(yī)學院,貴州 貴陽 550002;3.貴州省遵義市第三人民醫(yī)院,貴州 遵義 563000

醫(yī)院制劑血尿康膠囊質(zhì)量標準提升研究

楊小翠1李江2*黃詩婭2王孝東3

1.貴州省遵義市第四人民醫(yī)院,貴州 遵義 563004;2.貴陽中醫(yī)學院,貴州 貴陽 550002;3.貴州省遵義市第三人民醫(yī)院,貴州 遵義 563000

目的建立血尿康膠囊的質(zhì)量標準，為醫(yī)院制劑申報奠定基礎。方法采用薄層色譜法(TLC)對血尿康膠囊中女貞子、墨旱蓮、三七和焦梔子藥材進行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測定血尿康膠囊中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1的含量。結(jié)果TLC定性鑒別斑點清晰，分離度好，色譜特征明顯；HPLC測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別在0.01～0.12μg、0.15～1.8μg、0.04～0.48μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系，r值分別為0.9993、0.9991、0.9991，平均加樣回收率分別為96.74%、97.29%、97.52%，RSD分別為0.74%、1.79%、1.56%。結(jié)論方法簡便、可靠、專屬性強、重復性好、方法準確，可用于血尿康膠囊的質(zhì)量控制。

血尿康膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標準

血尿康膠囊的處方來源于中醫(yī)內(nèi)科副主任醫(yī)師楊小翠結(jié)合臨床所運用的滋腎化瘀清利湯(血尿康湯)，是貴州省遵義市第三人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，由女貞子、墨旱蓮、焦梔子、女貞子、三七粉、白花蛇舌草等十二味藥組成。其主要功效為滋陰化瘀，清熱止血，用于腎陰虧虛所致的腎性血尿癥。臨床上療效確切，需求量大。原血尿康湯方?jīng)]有固定的質(zhì)量標準，很難對藥品質(zhì)量進行控制，課題組擬將此方研究開發(fā)為治療腎陰虧虛所致的腎性血尿癥的膠囊劑，按照SFDA關于醫(yī)療機構(gòu)制劑的技術要求，完成血尿康膠囊處方研究、制劑工藝、質(zhì)量標準、穩(wěn)定性及臨床研究，并申請醫(yī)院制劑生產(chǎn)批件。本文主要報道質(zhì)量標準研究部分，通過建立該膠囊中的墨旱蓮、焦梔子、三七、女貞子藥材的薄層鑒別方法，并采用HPLC測定血尿康膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，最終建立血尿康膠囊的質(zhì)量標準，保證臨床用藥的安全、有效和穩(wěn)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日立(HITACHI)高效液相色譜儀，安靈ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)，電子天平(Sartorius德國賽多利斯),恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)；科導SK8210HP型臺式超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 血尿康膠囊及陰性樣品由貴州省遵義市中醫(yī)院藥劑科提供；齊墩果酸對照品(110709-200304，中國藥品生物制品檢定所)；梔子苷對照品(110749-201115，中國食品藥品鑒定研究院)；墨旱蓮對照藥材(120958-201106，中國食品藥品鑒定研究院)；人參皂苷Rb1(110704-200420)、人參皂苷Rg1(110703-200726)和三七皂苷R1(110745-200617)均購至中國藥品生物制品檢定所。硅膠G預制板(青島海洋化工廠生產(chǎn))；甲醇：色譜純。其余所用試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 女貞子的鑒別 取血尿康膠囊內(nèi)容物10g，加三氯甲烷30ml，超聲處理30min，濾過，濾液揮干，殘渣加1ml甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取齊墩果酸對照品適量，制成每1ml含1mg的溶液。作為對照品溶液。再取缺女貞子藥材v的血尿康膠囊內(nèi)容物10g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷—甲醇(8:1)作為展開劑[1-3]，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在106℃下加熱至斑點顯色清晰。分別置于日光燈下觀察，供試品色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液色譜無斑點(見圖1)。

1～3.供試品 4.齊墩果酸對照品 5.缺女貞子藥材陰性對照品

2.2 墨旱蓮的鑒別 取血尿康膠囊內(nèi)容物4.0g，加水50ml，加熱使溶解，用醋酸乙酯提取3次，每次30ml，合并醋酸乙酯液，用蒸餾水洗滌2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液水浴揮干，殘渣加醋酸乙酯1ml，使溶解，作為供試品溶液。另取墨旱蓮對照藥材0.5g和缺墨旱蓮藥材的血尿康膠囊內(nèi)容物4.0g，按供試品溶液制備的方法分別制成墨旱蓮對照藥材溶液和陰性對照品溶液，照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30℃～60℃)—甲酸乙酯—甲酸(15∶5∶0.9)的為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈光燈(365nm)下檢視[4-6]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照溶液色譜無斑點(見圖2)

1～3.供試品 4～5.墨旱蓮對照藥材 6.缺墨旱蓮陰性對照品

2.3 三七的鑒別 取膠囊內(nèi)容物2g，加石油醚(60℃～90℃)20ml，置于水浴上加熱回流30min，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇20ml，置水浴上加熱回流2h，過濾，濾液揮干，殘渣加水5ml溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次10ml，分取正丁醇液置于水浴上揮干，殘渣加甲醇2ml溶解，即可。分別精密稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1適量，分別加甲醇制成人參皂苷Rb1對照品溶液(1mg/ml)、人參皂苷Rg1對照品溶液(1mg/ml)、三七皂苷R1對照品溶液(1mg/ml)。另取缺三七的血尿康膠囊內(nèi)容物2g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷—乙酸乙酯—甲醇—水(15∶40∶25∶10)10℃下放置的下層液作為展開劑[7-10]，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至半點顯色清晰。分別置于日光燈與紫外光燈下觀察，供試品色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照溶液色譜無斑點(見圖3、圖4)。

1～3.供試品 4.人參皂苷Rg1對照品 5.人參皂苷Rb1對照品 6.三七皂苷R1對照品 7.缺三七藥材陰性對照品

1～3.供試品 4.人參皂苷Rg1對照品 5.人參皂苷Rb1對照品 6.三七皂苷R1對照品 7.缺三七藥材陰性對照品

2.4 焦梔子的薄層色譜鑒別 取膠囊內(nèi)容為5g，加甲醇20ml，超聲處理30min，濾過，濾液揮干，用5ml甲醇溶解，作為供試品溶液。另取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。再取缺梔子的血尿康膠囊內(nèi)容物5g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿—甲醇—氨水(5∶1∶0.1)為展開劑[11-14]，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照溶液色譜無斑點。(見圖5)

1～3.供試品 4～5.梔子苷對照品 6.缺梔子陰性對照品

3 三七總皂苷的含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 GeminiC18色譜柱(250×4.60mm，5μm)，流動相乙腈-水，梯度洗脫[15-21](0→14min,18%→22%乙腈，14→70min，22%→38%乙腈)；流速0.6ml·min-1；檢測波長203nm；柱溫：37℃；進樣量20μl。該條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1與鄰峰分離完全(分離度>1.5)，理論塔板數(shù)以三七皂苷R1峰計算不低于4000。陰性空白色譜圖在三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1位置處無干擾峰(見圖6)。

圖6-1 (對照品溶液)

圖6-2 (供試品溶液)

圖6-3 (陰性對照溶液)

3.2 對照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 0.01mg、人參皂苷Rg1 0.15mg和人參皂苷Rb1 0.04mg的混合溶液，備用。

3.3 供試品溶液的制備 精密稱取血尿康膠囊內(nèi)容物0.5g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50ml甲醇，稱精密稱重，回流2h，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液過0.45μm濾膜即可。

3.4 陰性對照溶液的制備 按處方中藥味比例，稱取除三七以外的其它藥材，同血尿康膠囊制備方法制成三七陰性對照溶液，取相當于供試品的量，再按“3.3”項方法制成陰性對照溶液。

3.5 線性關系考察 精密吸取上述對照品溶液1,3,5,7,10,12μl，分別注入高效液相色譜儀，按以上色譜條件測定，分別以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的實際進樣量(μg)X為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，計算3種皂苷的回歸方程，結(jié)果提示3種皂苷的線性關系良好。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的回歸方程分別為Y=11624X-10568、Y=76884X-60059、Y=35586X-24828，r值分別為0.9993、0.9991、0.9991，線性范圍分別為0.01～0.12μg，0.15～1.8μg，0.04～0.48μg。

3.6 精密度試驗 精密吸取同一濃度混合對照品溶液20μl，連續(xù)測定6次，測定3種皂苷的峰面積，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為：1.14%、1.49%和1.69%，提示儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性實驗 取樣品一份，精密稱定，照擬定的供試品制備方法制備樣品，分別于0、2、4、6、8小時進樣10μl，測定3種皂苷的峰面積，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為：1.25%、1.20%和1.73%，提示供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重現(xiàn)性試驗 取同一批號(20130511)血尿康膠囊，按“3.1.3”項下方法制備 6 份供試品溶液，分別進樣測定，結(jié)果樣品中三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Rb1含量平均值(n=6)分別為1.16mg/g，16.16mg/g，4.01mg/g。RSD值分別為1.09%，1.86%，1.48%。表明此法重現(xiàn)性良好。

3.9 加樣回收率試驗 取同一批血尿康膠囊內(nèi)容物各6份，精密稱定，分別加入三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對照品溶液適量(配成溶液加入)，按擬定的含量測定方法，測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量，計算回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1平均回收率分別為96.45%、96.57%、96.95%，相對標準偏差(RSD)分別為1.02%、0.68%、1.71%結(jié)果見表1。

3.10 樣品含量測定 取血尿康膠囊不同批號樣品，按供試品制備方法處理后測定，計算每粒膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果

4 討論

女貞子、墨旱蓮為方中君藥，二者合用共奏滋陰補腎，清熱涼血之功，墨旱蓮的鑒別首先采用旱蓮苷A、墨旱蓮對照藥材為對照品，但由于旱蓮苷A在該條件下不顯色，而墨旱蓮對照藥材有相應的斑點，故決定采用墨旱蓮對照藥材作為對照。在上述展開條件下樣品能更很好的分離，且陰性對照無干擾。女貞子鑒別中供試品溶液制備的取樣量分別考察了2g、4g、5g、10g、15g，其中10g與15g的取樣量所展開的結(jié)果相近，相比2g、4g、5g的展開結(jié)果好，故取樣量定為10g。焦梔子、三七的薄層鑒別研究中，薄層斑點分離良好，結(jié)果均能檢出相應色譜斑點，表明方法具有專屬性和重現(xiàn)性，可作為血尿康膠囊制劑質(zhì)量控制定性檢測指標。由于女貞子中專屬性成分含量輕微，缺乏定量依據(jù)，而方中三七為制劑中的臣藥，在本方中主要奏化瘀止血、補虛增強之功，且三七為貴重藥材，其總皂苷具有活血化瘀、補血活血的作用，三七中三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Rb1又是藥典規(guī)定要檢測的成分，所以對以上 3 種成分進行含量測定，能更有效地控制本品質(zhì)量。

本研究采用高效液相色譜方法測定三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Rb1的含量，并分別對精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率進行了考察。實驗結(jié)果表明所建立的方法穩(wěn)定、準確、可靠，可作為血尿康膠囊中三七皂 R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷 Rb1的含量的測定方法。

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ResearchtoimprovethequalitystandardofhospitalpreparationsXueniaokangcapsule

YANG Xiao-cui1,LI Jiang2,HUANG Shi-ya2,WANG Xiao-dong3

The Fourth People′s Hospital of Zunyi city Guizhou Province,Zunyi 563004,China;Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China;The third People′s Hospital of Zunyi city， Guizhou Province,Zunyi 563000,China

ObjectiveTo establish a method for the quality control of Xueniaokang capsule,laying the foundation for the application of hospital preparations.MethodLigustrum lucidum, Eclipta prostrate, Panax-notoginseng, Gardenia jasminoides were identified by thin-layer chromatography(TLC).The notoginsenoside R1 and notoginsenoside Rg1/Rb1 of Xueniaokang capsule was determined by HPLC.ResultThe characteristic for identification by TLC was distinct. The linear correlation of notoginsenoside R1 and notoginsenoside Rg1/Rb1 was good in the range of 0.01～0.12μg(r=0.9993), 0.15～1.8μg(r=0.9991), 0.04～0.48μg(r=0.9991), respectively. The range of the spotting recovery rate was 96.74%(RSD=0.74%), 97.29%(RSD=1.79%) and 97.52%(RSD=1.56%), respectively.ConclusionThe method is convenient and reliable with good specificity and reproducibility．It can be used for the quality control of Xueniaokang capsule．s

Xueniaokang capsule; TLC; HPLC; quality specification

此研究為貴州省科技廳2012年省市科技合作專項資金項目，課題編號：省市科合(2012)50號。

楊小翠(1971-),女,遵義市第四人民醫(yī)院副主任醫(yī)師,長期從事糖尿病、腎臟病的中西醫(yī)結(jié)合診治與臨床研究工作。E-mail:303630441@qq.com

李江(1973-)，現(xiàn)任貴陽中醫(yī)學院教授，博士學位，主要研究方向：中醫(yī)方劑配伍研究和民族藥系統(tǒng)研究與開發(fā)。E-mail:13984044866@139.com

R284.1

A

1007-8517(2014)14-0018-04

2014.05.25)