纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展

曹月喬，張國(guó)良,2*，王菲菲

(1．淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2．江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223003)

0 引言

近年來(lái)，隨著全球經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，原油消耗大幅增加，價(jià)格持續(xù)走高，能源供應(yīng)及安全問(wèn)題已成為世界各國(guó)需要面對(duì)的主要問(wèn)題之一?；茉丛谏a(chǎn)和使用的過(guò)程中排放出大量的二氧化碳和二氧化硫，造成全球變暖。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，對(duì)石油進(jìn)口的依賴(lài)程度不斷加大，開(kāi)發(fā)新能源和可替代能源，并提高其在能源結(jié)構(gòu)中的比例已經(jīng)迫在眉睫。近十多年來(lái)，作為替代能源之一的生物燃料乙醇(根據(jù)可發(fā)酵糖獲得來(lái)源，可將燃料乙醇分為：第一代常規(guī)生物燃料——“糖-淀粉”乙醇；第二代纖維素乙醇)在世界和我國(guó)已相繼開(kāi)展研究并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，特別是以甘蔗、玉米等糖類(lèi)作物為原料的第一代燃料乙醇產(chǎn)業(yè)已形成規(guī)模，在世界燃料乙醇供應(yīng)中起到舉足輕重的作用。2011 年，世界燃料乙醇生產(chǎn)大國(guó)——美國(guó)和巴西的幾乎全部燃料乙醇皆以玉米淀粉及甘蔗中的可發(fā)酵糖為原料生產(chǎn)而來(lái)，兩者乙醇產(chǎn)量之和為5900 萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)量6700 萬(wàn)噸的88%。

由于第一代生物燃料乙醇存在與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地以及成本高等問(wèn)題，嚴(yán)重制約著產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]，不適合我國(guó)國(guó)情，也不適宜在全國(guó)推廣。而纖維素生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年經(jīng)光合作用固定在綠色植物的總碳就達(dá)2×1011噸，其中絕大部分是構(gòu)成植物支撐組織的木質(zhì)纖維。我國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，生物質(zhì)資源豐富，僅每年產(chǎn)生的秸稈就多達(dá)7億多噸，大力發(fā)展以農(nóng)作物秸稈、木屑、廢紙等纖維素生物質(zhì)(主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[2])為原料的第二代纖維素乙醇被認(rèn)為是最有發(fā)展前途的非糧生物燃料之一，是木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)工業(yè)轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要方向，具有廣闊的發(fā)展前景。我國(guó)對(duì)纖維素乙醇的發(fā)展也很支持，政府將采取措施力保實(shí)現(xiàn)《可再生能源中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃》中的任務(wù)——到2020年實(shí)現(xiàn)生物燃料乙醇年利用量達(dá)1000萬(wàn)噸。發(fā)展纖維素乙醇對(duì)于解決當(dāng)前石油資源短缺、增加農(nóng)民收入以及減少環(huán)境污染等方面具有十分重要的意義。

利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的主要生產(chǎn)工藝包括原料預(yù)處理、纖維素水解、五碳糖與六碳糖發(fā)酵、乙醇分離等。本文對(duì)纖維素水解及燃料乙醇發(fā)酵工藝的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 分步水解發(fā)酵(SHF)

SHF工藝是纖維素酶法水解與糖發(fā)酵分步進(jìn)行，即先用纖維素酶水解木質(zhì)纖維素，再將酶解產(chǎn)生的糖液作為發(fā)酵碳源，纖維素的酶解和酶解液的發(fā)酵分別在不同的反應(yīng)器中進(jìn)行。其主要特點(diǎn)是水解與發(fā)酵分別都可在它們的最適條件下進(jìn)行，酶解主要工作條件為50～60℃，pH3～5；發(fā)酵主要工作條件為30～40℃，pH6～8。

在纖維素酶解過(guò)程中，纖維二糖的積累會(huì)抑制內(nèi)切和外切葡聚糖酶的活性，葡萄糖的積累對(duì)于β-葡萄糖苷酶的催化也有一定的抑制作用。隨著水解過(guò)程中葡萄糖濃度的不斷升高，酶解反應(yīng)很快就因?yàn)楫a(chǎn)物抑制作用而使反應(yīng)速度降低，反應(yīng)進(jìn)行不完全，這樣導(dǎo)致酶解糖化效率不高，從而影響后續(xù)發(fā)酵的乙醇得率[3]。

可以通過(guò)補(bǔ)加β-葡萄糖苷酶，減少纖維二糖的積累從而降低對(duì)外切葡聚糖酶的抑制作用，或者將反應(yīng)器內(nèi)糖化生成的葡萄糖通過(guò)超濾膜分離出去，從而消除產(chǎn)物抑制，提高反應(yīng)速度，但超濾膜的大規(guī)模應(yīng)用帶來(lái)成本的顯著增加。

2 同步糖化發(fā)酵(SSF)

SSF 工藝是目前木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化乙醇研究中運(yùn)用最多的一種方法，是纖維素酶法水解與發(fā)酵同步進(jìn)行。該工藝無(wú)需獨(dú)立的纖維素水解反應(yīng)器，減少了反應(yīng)器的數(shù)量，并且在加入纖維素酶的同時(shí)接種乙醇發(fā)酵的酵母菌，可使生成的葡萄糖被酵母菌發(fā)酵成乙醇，解除了酶解產(chǎn)生的糖的反饋抑制作用，提高了酶解的效率。

該工藝中由于纖維素酶解條件和發(fā)酵條件不匹配，尤其是反應(yīng)適宜溫度的不匹配(酶解適宜溫度50℃，發(fā)酵適宜溫度30℃)，導(dǎo)致發(fā)酵周期長(zhǎng)。為了使SSF 工藝的溫度達(dá)到最佳的酶解溫度，縮短發(fā)酵時(shí)間，可采用嗜熱酵母和細(xì)菌作為乙醇發(fā)酵菌株，選擇耐高溫酵母菌有利于SSF 技術(shù)的應(yīng)用。Krishna 等采用釀酒酵母同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵時(shí)的最佳溫度為38.5℃，而美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)使用釀酒酵母菌發(fā)酵的最佳條件是38℃，在最佳的酶、酵母和最適反應(yīng)條件下，可將80% 以上的纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇[4]。

在SSF工藝中，為兼顧酶解與發(fā)酵溫度，SSF一般采用的溫度為36～38℃，而且為了提高乙醇產(chǎn)率，常常對(duì)同步糖化發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。劉慶玉等以生物預(yù)處理后的玉米秸稈為原料，采用纖維素酶作為纖維素的糖化酶，采用釀酒酵母和樹(shù)干畢赤酵母對(duì)葡萄糖和木聚糖等混合糖進(jìn)行同步糖化發(fā)酵制取燃料乙醇[5]。以分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇含量，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種比例、纖維素酶用量4個(gè)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析，再通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。得到最適發(fā)酵參數(shù)分別為發(fā)酵溫度36 ℃，發(fā)酵時(shí)間96 h，接種比例1∶1，纖維素酶用量40 IU/g，最后乙醇產(chǎn)率為12.03%。

3 同步糖化共發(fā)酵(SSCF)

SSCF工藝是從SSF工藝的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的[6]，與SSF工藝相比，該工藝是纖維素酶法水解與己糖和戊糖發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，且是在同一個(gè)發(fā)酵罐中采用發(fā)酵菌種對(duì)己糖和戊糖進(jìn)行發(fā)酵。使用該工藝不僅可以節(jié)省設(shè)備投資費(fèi)用、有效緩解葡萄糖對(duì)纖維素酶的反饋抑制作用，而且還可以提高木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵液中的乙醇濃度。

Georgieva等將預(yù)處理過(guò)的小麥秸稈在pH5.0條件下發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同濃度的秸稈經(jīng)SSCF工藝發(fā)酵后葡萄糖的利用率均高于90%，且木糖轉(zhuǎn)化率在72%～80%之間[7]。密歇根州立大學(xué)的Jin等以柳枝稷為原料，在pH5.5、35℃條件下加入4%的纖維素酶，采用兩步法SSCF 技術(shù)得到最終木糖的濃度為11.2g/L，乙醇的濃度為32.1g/L，其中葡聚糖的轉(zhuǎn)化率為80.3%，木聚糖的轉(zhuǎn)化率為84.3%，說(shuō)明該工藝有利于緩解葡萄糖對(duì)纖維素酶的反饋抑制作用[8]。

此外，Koskinen 等將分離到的命名為K17、K15 兩株嗜熱厭氧菌共發(fā)酵木質(zhì)纖維素，能同時(shí)利用葡萄糖和木糖產(chǎn)生酒精和H2，菌株K17在酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)仍沒(méi)有明顯抑制效應(yīng)，有利于發(fā)酵液中乙醇的積累，提高木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵液中最終的乙醇濃度[9]。

該工藝中使用的菌種可以是混菌也可以是木糖代謝工程菌，木糖代謝工程菌一方面可以以有廣泛底物利用特性的微生物(如大腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌)為基礎(chǔ)，利用其本來(lái)就有的木糖、阿拉伯糖轉(zhuǎn)化能力，通過(guò)基因工程技術(shù)改善其產(chǎn)物的選擇性(例如導(dǎo)入轉(zhuǎn)化丙酮酸為乙醇的途徑，使其更多地生成乙醇，或阻斷其副產(chǎn)物合成途徑)及其它同合成產(chǎn)物相關(guān)的特性(如耐酒精及其它毒性抑制物的能力)；另一方面以已有很高產(chǎn)物選擇性和其它產(chǎn)物合成特性的乙醇發(fā)酵菌株(如釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌)為基礎(chǔ)，通過(guò)代謝工程手段賦予乙醇發(fā)酵菌株利用戊糖(木糖或阿拉伯糖)發(fā)酵的能力。如NREL將木糖異構(gòu)酶基因(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、轉(zhuǎn)酮醇酶基因(talB)及轉(zhuǎn)酮醛酶基因(tktA)利用基因工程方法，成功導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobiles)，實(shí)現(xiàn)了混合糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[10]。

4 非等溫同步糖化發(fā)酵(NSSF)

該法生產(chǎn)乙醇的工藝流程很好地解決了纖維素酶糖化與酵母發(fā)酵2個(gè)過(guò)程中溫度不匹配的矛盾，可節(jié)約纖維素酶30%～40%，同時(shí)乙醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率均顯著提高。

馬曉軒等將黑曲霉和康寧木霉混合菌經(jīng)過(guò)種子擴(kuò)增后接入秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基，在28℃、150r/min培養(yǎng)，在第140 h時(shí)再將培養(yǎng)液調(diào)至pH4.8，于55℃、150 r/min進(jìn)行酶解5 h，測(cè)還原糖量。隨后接入產(chǎn)朊假絲酵母，接種量10%，在28℃、100 r /min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48h，測(cè)定乙醇產(chǎn)量。結(jié)果顯示采用NSSF法的產(chǎn)糖量顯著大于SSF的產(chǎn)糖量，且NSSF發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量(0.14 g/g干秸稈)顯著大于SSF發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量[11]。原因是纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，并且在一定程度上可以抑制降解微生物對(duì)糖的消耗，NSSF法產(chǎn)生了更多的還原糖，而SSF法并不經(jīng)歷此階段。

Kang等利用耐高溫酵母菌CHY1612進(jìn)行該工藝時(shí)，溫度由糖化時(shí)的45℃調(diào)節(jié)至發(fā)酵時(shí)的35℃，得到的纖維素乙醇產(chǎn)量為34.3 g/L，明顯高于在45℃條件下進(jìn)行SSF時(shí)的產(chǎn)量22.2 g/L[12]。此時(shí)葡萄糖轉(zhuǎn)化率為89.3%，乙醇產(chǎn)率為90.6%。

5 直接微生物轉(zhuǎn)化法(DMC)

直接微生物轉(zhuǎn)化法又稱(chēng)聯(lián)合生物加工工藝(CBP)，是把生物質(zhì)制乙醇過(guò)程傳統(tǒng)工藝各單元進(jìn)行整合，即將纖維素酶的生產(chǎn)、酶解糖化和乙醇發(fā)酵三個(gè)單元耦合在一步同時(shí)進(jìn)行[13]，該工藝要求微生物或微生物群既能產(chǎn)生纖維素酶，又能利用可發(fā)酵糖類(lèi)生產(chǎn)乙醇。這樣既簡(jiǎn)化了工藝，又降低了成本。自然界中的某些微生物如Clostridium、Moniliar、Fusarium、Neurospora等都具有直接把生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇的能力。但到目前為止，研究的菌種耐乙醇濃度差，副產(chǎn)物多，乙醇濃度和得率低。

2009年，Mascoma 公司在紐約州Rome生產(chǎn)纖維素乙醇的裝置上使用了該技術(shù)，利用酵母和細(xì)菌共同完成纖維素酶的生產(chǎn)和乙醇發(fā)酵過(guò)程，減少了酶生產(chǎn)單元，大大降低了生產(chǎn)費(fèi)用。

6 間接生產(chǎn)乙醇技術(shù)

除上述直接通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方式，還有通過(guò)纖維素生物質(zhì)間接生產(chǎn)乙醇的技術(shù)。美國(guó)ZeaChem公司將廢木料利用酸水解得到葡萄糖和木糖，利用乙酸發(fā)酵菌將糖轉(zhuǎn)化為乙酸，然后乙酸酯化生成乙酸乙酯，乙酸乙酯加氫生成乙醇，氫氣由酸水解得到的木質(zhì)素氣化生產(chǎn)[14]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以利用整個(gè)木質(zhì)纖維素，提高了原料利用率，每噸干物質(zhì)的乙醇產(chǎn)量可達(dá)160加侖，相比于其它工藝，乙醇產(chǎn)率提高了50%。

Phillips將生物質(zhì)在隔絕氧氣的狀態(tài)下進(jìn)行高溫處理(600～1000℃)，得到混合裂解氣(主要成分是CO、CO2、H2、CH4和N2)；然后混合氣經(jīng)過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化途徑在金屬催化劑作用下轉(zhuǎn)化得到乙醇和C3以上的混合醇[15]。此外，還可以將混合氣整合后進(jìn)入發(fā)酵設(shè)備，通過(guò)細(xì)菌的作用轉(zhuǎn)化成乙醇[16]。該技術(shù)能將全部供入物料都用于氣化，產(chǎn)生極少的廢棄物，同時(shí)用水極少，節(jié)約了成本。

7 展望

目前，發(fā)展纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)面臨著生產(chǎn)成本居高不下的挑戰(zhàn)，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇需要滿足以下三個(gè)基本技術(shù)要求：簡(jiǎn)潔高效的原料預(yù)處理技術(shù)、高效低成本的纖維素酶、戊糖與己糖共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。因此，應(yīng)該主要從這三個(gè)方面著手以降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本。

7.1 預(yù)處理技術(shù)

纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理是生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵因素之一[17]。木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，細(xì)胞壁中的半纖維素和木質(zhì)素通過(guò)共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，纖維素鑲嵌其中，阻止酸或酶進(jìn)入纖維素和半纖維的區(qū)域，使得纖維素難以被水解。通過(guò)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理技術(shù)，改變天然纖維的結(jié)構(gòu)，使纖維素、半纖維素和木質(zhì)素得以分離，增加纖維素與酶的接觸面積，可提高纖維素的水解效率。

目前常見(jiàn)的預(yù)處理方法主要有物理法(機(jī)械粉碎法[18]、高溫處理法[19]、微波法[20])；化學(xué)法(酸水解法[21,22]、堿水解法[23]、有機(jī)溶劑法[24])；物理化學(xué)法(蒸汽爆破法[25]、氨纖維爆破法[26]、濕氧預(yù)處理法[27,28])；生物法[29]。

預(yù)處理過(guò)程中需要消耗大量的化學(xué)品或熱能，增加了設(shè)備投資或污水處理成本。此外，預(yù)處理可能還會(huì)產(chǎn)生對(duì)發(fā)酵有抑制或毒性的酚、醛、酸等有機(jī)物[30]。因此，應(yīng)重點(diǎn)發(fā)展原料轉(zhuǎn)化率高、低耗能、低污染的纖維素預(yù)處理技術(shù)，增加酶與植物纖維接觸的表面積[31]，并消除對(duì)微生物有危害的毒性物質(zhì)，以利于生物降解、提高預(yù)處理效率，減少成本。

7.2 纖維素酶

纖維素酶是降解纖維素成為葡萄糖所需的一組酶的總稱(chēng)，一般認(rèn)為其主要包括3個(gè)組分：內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纖維素酶的來(lái)源非常廣泛，昆蟲(chóng)、微生物、細(xì)菌、放線菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。目前應(yīng)用于纖維素酶生產(chǎn)的主要是木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、鐮孢菌屬(Fusarium)等菌種。

纖維素水解生成葡萄糖的過(guò)程必須依靠纖維素酶的協(xié)同作用才能完成。酶水解工藝具有條件溫和( pH為4.8，溫度為45～55℃) 、能量消耗小、不生成有毒降解產(chǎn)物、糖轉(zhuǎn)化率高、無(wú)腐蝕、無(wú)環(huán)境污染和無(wú)發(fā)酵抑制物等特點(diǎn)。但纖維素酶的生產(chǎn)成本占糖化總成本的60%，為整個(gè)生產(chǎn)成本的20%左右[32]。目前使用的纖維素酶的比活力較低，單位原料用酶量很大，酶解效率低。因此，應(yīng)該積極開(kāi)發(fā)高效生物酶，降低生產(chǎn)成本，優(yōu)化酶水解工藝，從而降低生產(chǎn)纖維素燃料乙醇的成本。

近年來(lái)，世界上兩個(gè)最大的產(chǎn)酶公司Genencor International 和Novozymes Biotech加大了對(duì)纖維素酶的研究力度，努力增加酶活并降低成本，以生產(chǎn)最高效的纖維素酶，如Cellic CTec2 酶[33]等；我國(guó)山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和誘變育種以及用基因手段提高產(chǎn)酶量或改進(jìn)酶系組成等進(jìn)行了研究。其中，誘變育種是一個(gè)有效的途徑，并且已經(jīng)獲得了纖維素酶活力顯著提高的菌株，如斜臥青霉(P.decumbens)JUA10-1、JUA10-S、JUA10-T等。此外，通過(guò)基因組重排技術(shù)獲得產(chǎn)酶能力較出發(fā)菌株提高了2 倍以上的GS2-15、GS2-21、GS2-22等[34-38]。

7.3 發(fā)酵微生物

在纖維素生物質(zhì)酶解糖化過(guò)程中，有20%左右的半纖維素降解為戊糖，而自然界中高效的乙醇發(fā)酵菌株缺少利用和轉(zhuǎn)化戊糖的能力或轉(zhuǎn)化效率很低，這無(wú)疑降低了木質(zhì)纖維素的乙醇轉(zhuǎn)化率[39-41]。而理想的生物質(zhì)乙醇發(fā)酵菌應(yīng)該能夠發(fā)酵所有生物質(zhì)來(lái)源的糖，并與纖維素完全水解所需的纖維素酶有協(xié)同作用。因此，構(gòu)建能夠利用戊糖的工程菌就顯得尤為重要。

目前，利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)構(gòu)建基因重組菌株，是獲得代謝葡萄糖和木糖高效產(chǎn)乙醇重組菌株的一條重要途徑。通過(guò)打斷琥珀酸合成途徑中的延胡索酸合成酶基因，產(chǎn)生的名為KO11 的大腸桿菌可發(fā)酵半纖維素水解產(chǎn)物中的幾乎所有的糖生產(chǎn)乙醇，其乙醇生產(chǎn)能力較高，并且對(duì)木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的抑制劑具有相對(duì)高的耐受性；此外，美國(guó)Purdue 大學(xué)將木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因轉(zhuǎn)入了糖化酵母(S.diastaticus)和葡萄汁酵母(S.uvarum)的融合菌株，該菌能同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖為酒精，提高了發(fā)酵酒度和底物利用率。

7.4 其他

制定原料供應(yīng)保障制度，建立有效的纖維素生物質(zhì)收集、儲(chǔ)存及運(yùn)輸體系，解決制約纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原料供應(yīng)問(wèn)題，確保纖維素燃料乙醇健康有序發(fā)展；完善燃料乙醇的補(bǔ)貼政策，建議國(guó)家根據(jù)燃料乙醇生產(chǎn)原料分別確定補(bǔ)貼，使對(duì)纖維素乙醇的補(bǔ)貼高于第一代燃料乙醇，提高社會(huì)對(duì)發(fā)展該產(chǎn)業(yè)的積極性；此外，建議國(guó)家在纖維素燃料乙醇的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化示范上提供財(cái)政支持，并出臺(tái)相應(yīng)扶持政策，整合國(guó)內(nèi)研發(fā)力量，推動(dòng)纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化技術(shù)早日實(shí)現(xiàn)。

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