霸王花褐腐病的病原鑒定

藍(lán)國兵，何自福，羅方芳，湯亞飛，佘小漫，杜振國

(1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東廣州 510640;2廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

霸王花褐腐病的病原鑒定

藍(lán)國兵1，2，何自福1，2，羅方芳1，湯亞飛1，佘小漫1，杜振國1

(1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東廣州 510640;2廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

【目的】明確導(dǎo)致廣東省霸王花Hylocereus undatus褐腐病的病原種類.【方法】通過病組織分離、致病性測定、形態(tài)學(xué)觀察及rDNA序列分析等方法對廣東省霸王花褐腐病病原進(jìn)行了種類鑒定.【結(jié)果和結(jié)論】在PDA培養(yǎng)基上，病原菌的菌落為深灰色，絨毛狀.產(chǎn)生2種類型的節(jié)孢子：一種為淺色、薄壁的柱狀孢子，大小為(5.00～10.69)μm ×(2.61～4.52)μm;另一種為褐色、厚壁、圓形或橢圓形、基部平截、成鏈的孢子，大小為(5.15～12.39)μm× (3.87～6.07)μm.應(yīng)用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR，獲得該病原菌579 bp的18S-28S rDNA ITS序列.BLAST結(jié)果顯示，該序列與Neoscytalidium dimidiatum火龍果菌株的18S-28S rDNA ITS序列相似性最高，為99%～100%.這些研究結(jié)果表明，引起廣東省霸王花褐腐病的病原菌為N.dimidiatum.

霸王花;褐腐病;病原鑒定

霸王花Hylocereus undatus(Haw.)Britt.et Rose又名劍花、量天尺等，屬仙人掌科量天尺屬，分布于澳大利亞、美國以及我國廣東、廣西、福建、海南、臺灣等地［1-2］.霸王花的花朵具有食用和藥用價值，其花的加工產(chǎn)品在國內(nèi)外市場十分暢銷，主要用作湯料或蔬菜食用，具有強(qiáng)身健體、清補(bǔ)養(yǎng)生功效［3］.近年來，隨著人工栽培面積的不斷擴(kuò)大，霸王花病害問題日益突出，嚴(yán)重地影響了霸王花的生產(chǎn).2011年秋，在廣東省臺山市沖蔞鎮(zhèn)的霸王花種植區(qū)暴發(fā)了一種新病害.病株莖稈上先出現(xiàn)褐色近圓形病斑，病情發(fā)展較快，病斑擴(kuò)大且數(shù)量不斷增多，最終導(dǎo)致莖稈腐爛枯死.為了弄清霸王花褐腐病的病原，為病害防治提供科學(xué)依據(jù)，本研究對引起霸王花褐腐病的病原進(jìn)行了鑒定.

1 材料與方法

1.1 材料

霸王花褐腐病的病樣采集于廣東省臺山市沖蔞鎮(zhèn).觀察所用顯微鏡型號為ECLIPSE 90i顯微鏡，尼康公司產(chǎn)品.試驗(yàn)所用試劑主要購自TaKaRa公司，引物ITS1和ITS4合成于上海英俊生物技術(shù)有限公司.

1.2 病原菌分離、純化和致病性測定

采用植物病原真菌病組織常規(guī)分離法［4］進(jìn)行病原菌分離.菌株經(jīng)單孢分離純化后，保存于PDA斜面上，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?采用菌絲塊接種和孢子懸浮液注射接種2種方法，分別對分離菌株的致病性進(jìn)行測定.菌絲塊接種方法為：將分離菌株BWH-TS1在PDA平板上活化，27℃培養(yǎng)3 d后用直徑為0.5 cm的打孔器在菌落邊緣打孔，然后將菌餅置于經(jīng)清水洗凈的健康霸王花莖稈上(用挑針造成微傷口)，以PDA塊做空白對照.孢子懸浮液注射接種方法為：將菌株BWH-TS1在PDA平板上27℃活化培養(yǎng)7 d，然后用無菌水將孢子洗下，并配成濃度為1×106mL-1的孢子懸浮液，用無菌注射器將100 μL的孢子懸浮液注射到健康的霸王花莖稈內(nèi)，注射等量無菌水的健康植株為空白對照.每處理3個重復(fù)，27℃黑暗保濕培養(yǎng)，接種后3～15 d觀察發(fā)病情況，并對接種后發(fā)病的組織進(jìn)行病原菌再分離.

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察將待鑒定的病原菌株在PDA平板上活化，27℃培養(yǎng)30 d，不定期觀察菌落特征，包括菌落大小、顏色、分泌物和質(zhì)地等，顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)特征，并測量分生孢子大小.根據(jù)真菌分類有關(guān)文獻(xiàn)［5-8］進(jìn)行鑒定.

1.3.2 病原菌rDNA-ITS序列分析CTAB法［9］提取病原菌菌株BWH-TS1基因組DNA.以真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增［10］.PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板1.5 μL(20～30 ng)，引物ITS1 (10 μmol/L)和ITS4(10 μmol/L)各2 μL，Premix ExTaq?Version 2.0 25 μL(TaKaRa公司)，ddH2O 19.5 μL.PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性6 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，進(jìn)行35個循環(huán);最后72℃延伸10 min.在質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠上檢測PCR結(jié)果，對PCR擴(kuò)增獲得的約600 bp特異片段進(jìn)行克隆，送上海生工生物技術(shù)有限公司測序，并進(jìn)行BLAST同源性比對.

2 結(jié)果與分析

2.1 霸王花病株田間癥狀

霸王花植株感病后，癥狀最初表現(xiàn)為莖稈表皮產(chǎn)生許多褪綠小病斑，15 d左右病斑上形成近圓形黃褐色凸起小斑點(diǎn)，病斑直徑大小2～5 mm.隨著病情的發(fā)展，病斑不斷增多，病斑不斷擴(kuò)大，甚至多個病斑連在一起形成更大的病斑，呈褐色或深褐色.后期病斑連成一片，病斑組織腐爛，造成整條莖稈腐爛枯死(圖1).

圖1 霸王花褐腐病的癥狀Fig.1 Symptoms of plants caused by Hylocereus undatus

2.2 病原菌致病性測定結(jié)果

通過植物病原真菌常規(guī)病組織分離方法，分離獲得3株形態(tài)一致的菌株，選取其中1株(菌株編號為BWH-TS1)用于致病性測定.將菌株BWH-TS1的菌絲塊接種在用挑針造成微傷口的健康霸王花莖稈上，27℃條件下，3 d后即能觀察到水浸狀的小病斑出現(xiàn);病斑隨后慢慢擴(kuò)大，接種15 d后形成直徑為

1.3 cm左右褐色病斑，與田間癥狀相同，而對照沒有表現(xiàn)癥狀(圖2).菌株BWH-TS1孢子懸浮液注射接種在霸王花莖稈上，27℃條件下，3 d后也出現(xiàn)水浸狀的病斑，接種7 d后病斑擴(kuò)展到1.0 cm左右，與病害的田間后期癥狀基本一致，對照沒有病癥(圖2).對接種后發(fā)病的組織進(jìn)行再分離，均能獲得與接種菌株形態(tài)一致的病原菌.因此，菌株BWH-TS1為霸王花褐腐病的致病菌.

圖2 霸王花莖稈接種菌株BWH-TS1的癥狀Fig.2 Symptoms of the night-blooming cereus stem inoculated with strain BWH-TS1

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

在PDA培養(yǎng)基上，霸王花病原菌株菌落初期淺白色，平鋪;后期菌落呈深灰色，絨毛狀.菌落生長較快，27℃黑暗培養(yǎng)3 d菌落直徑即可達(dá)9 cm(圖3).在PDA培養(yǎng)基上，該病原菌可產(chǎn)生2種類型的節(jié)孢子(圖3)：一種是由菌絲或側(cè)生菌絲斷裂產(chǎn)生的淺色、薄壁的柱狀孢子，孢子大小為7.83(5.00～ 10.69)μm×3.60(2.61～4.52)μm;另一種是由菌絲厚垣化斷裂形成的褐色、厚壁、圓形或橢圓形、基部平截、成鏈的孢子，孢子大小為7.09(5.15～12.39)μm×4.69(3.87～6.07)μm.沒有觀察到該菌的有性階段.根據(jù)這些特征，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［5-8］，將引起廣東省霸王花褐腐病的病原菌初步鑒定為Neoscytalidium dimidiatumCrous＆Slippers.

圖3 病原菌Neoscytalidium dimidiatum的形態(tài)觀察Fig.3 Morphological characteristics of Neoscytalidium dimidiatum

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析結(jié)果

應(yīng)用真菌18S-28S rDNA間隔區(qū)序列(ITS)的通用引物ITS1和ITS4，從菌株BWH-TS1的DNA中PCR擴(kuò)增到一條約600 bp的片段.序列測定結(jié)果顯示，該特異片段長度為579 bp(GenBank No.JX473739).BLAST比對結(jié)果表明，BWH-TS1 18S-28S rDNA ITS序列與已報道的侵染火龍果的N.dimidiatum中國臺灣菌株(HQ439174)的序列相似性為99%，與N.dimidiatum廣東菌株(JX128103，JX128104，JX524168)的序列相似性為100%.該結(jié)果進(jìn)一步支持引起霸王花褐腐病的病原菌為N.dimidiatum.

3 討論與結(jié)論

應(yīng)用常規(guī)的植物病原真菌研究方法，從霸王花病樣組織中成功分離獲得病原菌.根據(jù)該病原菌的形態(tài)學(xué)特征及其18S-28S rDNA ITS序列，將該病原菌鑒定為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色孢科、新節(jié)格孢屬的Neoscytalidium dimidiatum.

霸王花和火龍果H.undatus＆H.polyrhizus在形態(tài)上十分接近，均為仙人掌科量天尺屬Hylocereus植物，但在生產(chǎn)中霸王花只開花不結(jié)果［11］.2012年，我國臺灣和廣東相繼報道了N.dimidiatum侵染引起的火龍果莖腐?。?-8］，其病害癥狀與發(fā)生在霸王花上的褐腐病癥狀相似，這說明N.dimidiatum不僅可以侵染霸王花，而且也侵染火龍果.

新節(jié)格孢屬Neoscytalidium是Crous等［6］對Botryosphaeriaceae發(fā)育系統(tǒng)研究中建立的一個新屬，模式種為N.dimidiatum.該屬的主要特征是：在呈粉末狀氣生菌絲上產(chǎn)生鏈狀分生節(jié)孢子;節(jié)孢子易斷裂脫落，基部平截，圓柱形或鈍橢圓形，暗褐色，細(xì)胞壁厚，0～2隔膜.自該屬建立以來，國內(nèi)外已有一些文獻(xiàn)報道了N.dimidiatum侵染引起的病害，如發(fā)生在意大利的甜橙Citrus sinensis枝條潰瘍病［12］、美國加州的無花果Ficus carica枝枯病［13］、澳大利亞的猢猻樹Adansonia perrieri枝枯?。?4］、我國臺灣和廣東的火龍果莖腐病［7-8］等.可見，該病原菌的寄主比較廣泛，可以侵染多種重要經(jīng)濟(jì)作物，造成枝枯、潰瘍及莖腐等癥狀，但在仙人掌科上的危害目前已報道的僅有量天尺屬Hylocereus［7-8］.另外，也有研究者［15］將導(dǎo)致火龍果果實(shí)腐爛的病原菌鑒定為Scytalidium dimidiatum(Penz.)Sutton and Dyko，而Scytalidium dimidiatum為N.dimidiatum的同物異名.

2012年3—6月，廣東雨水比往年偏多，高溫潮濕的天氣導(dǎo)致霸王花褐腐病發(fā)生特別嚴(yán)重，在部分霸王花種植區(qū)暴發(fā)流行，導(dǎo)致毀園失收.對于該新病害的發(fā)生規(guī)律及病害防治有效藥劑篩選等研究還在進(jìn)行.

致謝：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)姜子德教授和習(xí)平根副教授在病原菌鑒定方面給予了指導(dǎo)，特此致謝!

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【責(zé)任編輯霍歡】

Identification of the pathogen causing brown rot of Hylocereus undatus

LAN Guobing1，2，HE Zifu1，2，LUO Fangfang1，TANG Yafei1，SHE Xiaoman1，DU Zhenguo1(1 Institute of Plant Protection，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China; 2 Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou 510640，China)

【Objective】To confirm the pathogen species that caused brown rot disease onHylocereus undatus.【Method】Diseased tissue isolation，indoor pathogenicity test，morphological observation and rDNA sequence analysis were used to confirm the pathogen species.【Result and conclusion】The colonies of the fungus were dark grey and fluffy on potato dextrose agar(PDA)medium.Two kinds of arthrospore were observed on PDA medium.One was columnar conidium with light-colored，thin-walled and(5.00-10.69)μm×(2.61-4.52)μm in size，and the other was chained conidium with dark brown，thickwalled，circular or oval，base truncate and(5.15-12.39)μm×(3.87-6.07)μm in size.Using PCR with primers ITS1 and ITS4 for internal transcribed spacer(ITS)sequences of fungal 18S-28S rDNA，the sequence was cloned to be 579 bp in length.The BLAST results showed that the sequence had the highest sequence identity with that ofNeoscytalidium dimidiatumstrains isolated from pitahaya (99%-100%).These results indicated that night-blooming cereus brown rot in Guangdong was caused byN.dimidiatum.

Hylocereus undatus;brown rot;pathogen identification

S436.418.11

A

1001-411X(2014)01-0060-04

藍(lán)國兵，何自福，羅方芳，等.霸王花褐腐病的病原鑒定［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(1)：60-63.

2013-02-21優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1611.019.html

藍(lán)國兵(1984—)，男，碩士，助理研究員，E-mail:languo020@163.com;通信作者:何自福(1966—)，男，研究員，博士，E-mail:hezf@gdppri.com

星火計劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2011GA780007);國際科技合作項(xiàng)目(2011DFB30040);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊專項(xiàng)