體外誘導嗜水氣單胞菌對喹諾酮類耐藥及其耐藥機制研究

鄧玉婷，薛慧娟，2，姜蘭，譚愛萍，吳雅麗，王偉利，羅理，趙飛

(1中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術重點實驗室，廣東廣州 510380;2上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

體外誘導嗜水氣單胞菌對喹諾酮類耐藥及其耐藥機制研究

鄧玉婷1，薛慧娟1，2，姜蘭1，譚愛萍1，吳雅麗1，王偉利1，羅理1，趙飛1

(1中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部漁用藥物創(chuàng)制重點實驗室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術重點實驗室，廣東廣州 510380;2上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

【目的】探討在亞抑菌濃度喹諾酮類藥物培養(yǎng)后，嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila對喹諾酮類的藥物敏感性變化及其耐藥機制.【方法】以對喹諾酮類敏感的臨床分離嗜水氣單胞菌菌株和標準菌ATCC7966為研究對象，分別在含亞抑菌濃度萘啶酸(NAL)和環(huán)丙沙星(CIP)的培養(yǎng)基上逐步誘導培養(yǎng).提取誘導菌的DNA，PCR擴增其gryA和parC基因，測序分析其喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)突變情況;測定誘導菌對誘導藥物和11種非誘導藥物的最小抑菌濃度(MIC)及添加外排泵抑制劑羰基氰化氯苯腙(CCCP)后的MIC，分析其敏感性變化與基因突變、外排作用的關系.【結(jié)果和結(jié)論】誘導后菌株對萘啶酸和環(huán)丙沙星的MIC分別提高了1 024和64 000倍，對非誘導藥物也有不同程度提高;當萘啶酸和環(huán)丙沙星誘導濃度分別達到16和32 μg/mL或以上后，誘導菌株gyrA基因編碼的氨基酸分別發(fā)生Asp87→Tyr和Ser83→Arg的變化，但兩者parC基因編碼的氨基酸均沒有發(fā)生突變;添加CCCP后，只有氟喹諾酮類藥物的MIC值略有下降，提示嗜水氣單胞菌對喹諾酮類耐藥存在靶基因突變及主動外排作用等多種耐藥機制.

嗜水氣單胞菌;喹諾酮類;體外誘導;基因突變;外排作用

嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila是一類屬于氣單胞菌科Aeromonadaceae、氣單胞菌屬Aeromonas的革蘭陰性短桿菌，是我國流行最廣泛的一種典型人-獸-水生動物共患病病原菌，在自然界中廣泛分布，可以感染各種淡水魚、兩棲動物、鳥類、哺乳動物［1］.嗜水氣單胞菌可引起養(yǎng)殖魚類細菌性敗血癥的暴發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失.喹諾酮類藥物具有高效、副作用小、抗菌譜廣等優(yōu)點，是目前治療嗜水氣單胞菌感染的主要藥物.然而，隨著該藥的普遍使用，耐藥率逐年上升.耐藥菌株的產(chǎn)生使得藥效下降甚至失效，給臨床治療帶來了極大的困難.

迄今為止，已報道的細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制主要有4種：靶基因突變，主動外排系統(tǒng)，細菌細胞膜通透性的改變以及質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥機制，其中前3種耐藥機制均為染色體突變介導的［2］.研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥機制引起細菌對氟喹諾酮類藥物的低水平耐藥，而染色體突變介導的耐藥可引起細菌對喹諾酮類藥物的高水平耐藥［3-5］.喹諾酮類藥物作用于革蘭陰性細菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構酶IV，DNA旋轉(zhuǎn)酶由2個GyrA亞基和2個GyrB亞基組成，拓撲異構酶IV由2個ParC亞基和2個ParE亞基組成.當這2個酶的基因發(fā)生突變，導致一個或多個結(jié)構發(fā)生改變，增加了細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性，這些突變位點通常發(fā)生在這2種酶不連續(xù)的序列中，稱其為喹諾酮類耐藥決定區(qū)(Quinolone resistance-determining regions，QRDR)［2］.目前認為靶基因gyrA和parC的喹諾酮類耐藥決定區(qū)與氣單胞菌喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生密切關聯(lián)［6-9］.國內(nèi)外研究均是對嗜水氣單胞菌臨床分離株的耐藥檢測［6-9］，而對體外應用喹諾酮類藥物誘導選擇相應的高度耐藥菌及其靶基因喹諾酮類耐藥決定區(qū)突變情況的研究則報道較少.為探討靶基因突變引起的嗜水氣單胞菌耐藥機制，本文應用萘啶酸和環(huán)丙沙星以體外連續(xù)誘導的方式誘導出高度耐藥菌，并通過聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)分析喹諾酮類耐藥決定區(qū)靶基因突變情況及主動外排系統(tǒng)對菌株藥物敏感性的影響，以探討體外誘導下嗜水氣單胞喹諾酮類耐藥機制，進而了解臨床使用喹諾酮類藥物對細菌耐藥性的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源誘導受試菌株為中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害與免疫研究室臨床分離的魚源嗜水氣單胞菌BZ和嗜水氣單胞菌標準菌株ATCC7966，前期試驗已就受試菌株對常見抗菌藥物進行藥敏試驗［9］，并鑒定為喹諾酮類藥物敏感菌株.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害與免疫研究室保存的臨床分離鱉源嗜水氣單胞菌44A，已鑒定對萘啶酸、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星耐藥［9］.標準菌ATCC7966由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚病研究室饋贈，質(zhì)控菌ATCC25922由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院藥理教研室饋贈.

1.1.2 受試藥物、培養(yǎng)基、酶和其他試劑恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)、洛美沙星(Lomefloxacin，LOM)、多西環(huán)素(Doxycycline，DOX)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、甲氧芐啶(Trimethoprim，TMP)、氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)LR)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)及新霉素(Neomycin，NEO)均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品;萘啶酸(Nalidixic acid，NA)為廣州康龍生物科技有限公司產(chǎn)品.以上藥物用無菌雙蒸水配成1 024 μg/mL的儲存液，分裝后-20℃條件保存?zhèn)溆茫褂脮r再稀釋成所需濃度.羰基氰化物間氯苯腙(Cyanide chlorophenyl hydrazone，CCCP)為美國Sigma公司產(chǎn)品.PCR反應試劑均為康為世紀公司產(chǎn)品.胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptone soya agar，TSA)、LB瓊脂(Luria-bertani agar)、LB肉湯(Luria-bertani broth)、水解酪蛋白肉湯(Muller-hinton broth，MH肉湯)，為青島海博生物技術有限公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感試驗采用微量肉湯稀釋法測定受試菌以及誘導試驗中所有培養(yǎng)濃度下的誘導菌株對12種受試藥物的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC).同時，培養(yǎng)基中加入10 μg/mL的CCCP，再測定添加后的MIC.每次試驗設置陽性對照(培養(yǎng)基加菌液)和陰性對照(僅加培養(yǎng)基)，同時用大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株.

1.2.2 體外誘導試驗依據(jù)菌株藥物敏感性結(jié)果，將受試菌株分別接種在含有1/4×MIC的萘啶酸和環(huán)丙沙星的固體培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，并逐步2倍提高誘導藥物質(zhì)量濃度，依次在1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC等的含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，至誘導藥物質(zhì)量濃度達到128 μg/mL為止.同時將受試菌株在不含藥液的固體培養(yǎng)基中同步傳代培養(yǎng)作為對照，用微量稀釋法測定每代誘導菌株的MIC.

1.2.3 交叉耐藥試驗將誘導篩選出的耐藥菌株在TSA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，用微量稀釋法測定菌株對非誘導藥物的MIC，并比較誘導前后的MIC變化.若藥物誘導后菌株對非誘導藥物的MIC比誘導前升高4倍或以上，則為交叉耐藥.

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗將誘導后的菌株在不含藥物的TSA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20代，每1～2 d接種傳代1次，依次測定第5、第10、第15、第20代傳代菌株的MIC，以此判斷其耐藥的遺傳穩(wěn)定性.同時也以臨床分離喹諾酮類耐藥菌44A作為對照按上述方法進行試驗.

1.2.5 細菌模板DNA提取采用水煮法提取菌株模板DNA.挑取純化后的單菌落劃于LB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12～16 h，用接種環(huán)挑取適量菌苔于含500 μL 1×TE的1.5 mL滅菌離心管，混勻后煮沸10 min，冰浴5 min，1 2000 r/min離心1 min，提取上清液即為DNA模板.

1.2.6 PCR擴增靶基因gyrA和parC及DNA序列分析根據(jù)參考文獻［9］報道的相應引物序列，由上海博尚生物技術有限公司合成.引物序列、各PCR反應的退火溫度見表1.將經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性的PCR擴增產(chǎn)物送交上海博尚生物技術有限公司測序，將測序結(jié)果用BLAST軟件(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)參照GenBank上標準嗜水氣單胞菌序列進行序列比對分析，找出氨基酸序列突變位點.

2 結(jié)果

2.1 體外誘導菌株對喹諾酮類藥物及其他藥物MIC的變化

受試菌分別用誘導藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星從1/4×MIC開始，通過體外誘導獲得萘啶酸和環(huán)丙沙星MIC均為128 μg/mL的高耐誘導菌.高耐誘導菌對萘啶酸和環(huán)丙沙星的MIC與誘導前相比，分別提高了1 024和64 000倍;對非誘導藥物恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星的MIC比誘導前增加了32～2 048倍，呈現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象;除甲氧芐啶外，對土霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素和新霉素等其他類藥物的MIC比誘導前增加了2～16倍(表2).

2.2 誘導耐藥菌株的穩(wěn)定性

經(jīng)萘啶酸誘導的高耐菌株在無藥平板連續(xù)傳20代后對萘啶酸的MIC值仍保持在128 μg/mL，說明具有較好的遺傳穩(wěn)定性.經(jīng)環(huán)丙沙星誘導的高耐菌株傳代20代后，對環(huán)丙沙星的MIC值從128 μg/mL降到16 μg/mL，但仍在耐藥范圍之內(nèi).臨床分離的耐藥菌44A在傳代前對萘啶酸和環(huán)丙沙星的MIC分別為＞128和128 μg/mL，傳代20代后的MIC維持不變.

2.3 誘導菌株的喹諾酮類耐藥決定區(qū)突變

PCR擴增所有不同誘導質(zhì)量濃度下獲得的菌株靶基因gyrA和parC并進行序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當萘啶酸誘導質(zhì)量濃度達16 μg/mL或以上后獲得的菌株其gyrA編碼的氨基酸第87位天冬氨酸(Asp)均突變?yōu)槔野彼?Tyr);而環(huán)丙沙星誘導質(zhì)量濃度達32 μg/mL或以上后獲得的菌株其gyrA編碼的氨基酸均發(fā)生第83位的絲氨酸(Ser)突變?yōu)榫彼?Arg);2種藥物誘導后的菌株均未檢測到ParC突變.而經(jīng)過穩(wěn)定性試驗后的4株誘導菌，檢測其靶基因，其GyrA的突變?nèi)源嬖?，也沒有其他位點的變化(表2).

2.4 CCCP對受試菌MIC的影響

加入外排泵抑制劑CCCP(10 μg/mL)后，誘導菌對5種氟喹諾酮類藥物的MIC比未添加前有小范圍的降低，降低幅度為2～4倍，而對萘啶酸沒有作用.對于其他類藥物，添加CCCP后其MIC基本上沒有改變.

表2 誘導前后及加入CCCP前后誘導菌株對12種藥物的MIC變化及喹諾酮類耐藥決定區(qū)突變情況Tab.2 MICs of 12 antimicrobials before and after selection as well as CCCP added and quinolone resistance-determining region mutations of the strains

3 討論與結(jié)論

有研究表明，基于MIC的治療濃度，僅能阻止大部分敏感細菌的生長，但會使一些突變耐藥菌株得到選擇性的富集和擴增［10］.本研究分別以萘啶酸和環(huán)丙沙星對臨床分離的嗜水氣單胞菌和標準菌株ATCC7966從1/4×MIC開始到128 μg/mL進行逐級誘導，128 μg/mL誘導后的菌株對測定的喹諾酮類各種藥物呈現(xiàn)出交叉耐藥，對其他類藥物也呈現(xiàn)不同程度的耐藥;驗證了當嗜水氣單胞菌從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度的喹諾酮類藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，非但不能完全殺死細菌，反而篩選出高度耐藥菌.

喹諾酮類藥物第1代以萘啶酸為代表及第3代以環(huán)丙沙星為代表的2種藥物，由于環(huán)丙沙星在基本結(jié)構上引進不同基團后，與靶位點的結(jié)合能力增強，并介入了其他作用機制，因此其自發(fā)突變的頻率比結(jié)構簡單的萘啶酸低了1 000倍，為10-9～10-11μg/mL［2，11］.本試驗中，當萘啶酸誘導質(zhì)量濃度達16 μg/mL、環(huán)丙沙星達32 μg/mL或以上時，只有gyrA基因編碼的氨基酸發(fā)生突變，分別為Asp87→Tyr和Ser83→Arg;而parC基因編碼的氨基酸一直沒有發(fā)生突變.而我們對臨床分離的喹諾酮類耐藥嗜水氣單胞菌的QRDR突變研究發(fā)現(xiàn)，萘啶酸耐藥菌株的GyrA均發(fā)生突變，為Ser83→Ile，而環(huán)丙沙星耐藥菌株除了GyrA突變外，其ParC亦同時發(fā)生突變，為Ser87→Ile或Ser87→Arg［9］.國內(nèi)外研究報道，臨床分離的喹諾酮類耐藥氣單胞菌在GyrA第83位氨基酸多發(fā)生Ser→Ile突變，也有部分突變?yōu)锳rg、Val或Asn［7-9］;而ParC在第80位變異最多，為Ser→Ile，也有突變?yōu)門hr及Arg［7-8］.誘導獲得的與臨床分離的耐藥菌株靶位點突變存在差異，其原因可能是受自然條件多種因素的影響，造成臨床菌株發(fā)生基因突變是多方向的、隨機的，而誘導菌株是在人為干預下只添加一種藥物篩選的，突變較為單一.

有研究表明，細菌對喹諾酮類藥物耐藥性的演變方式是由單點突變向多點突變方向逐漸發(fā)展［2，11］.在大腸埃希菌喹諾酮類耐藥機制研究中發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌對氟喹諾酮類耐藥性的獲得經(jīng)歷4個階段，首先是GyrA的單位點突變，引起環(huán)丙沙星的低水平耐藥(MIC為0.125～0.250 μg/mL);第2階段是ParC的單位點突變，導致對環(huán)丙沙星的中度耐藥(1～4 μg/mL);第3階段GyrA第2個位點的突變以及第4階段ParC第2個位點的突變，引起對環(huán)丙沙星的高度耐藥，其MIC可分別達到8～64和128 μg/mL［2］.從誘導試驗可以看出，萘啶酸從低質(zhì)量濃度到高質(zhì)量濃度誘導獲得的耐藥菌只發(fā)生GyrA改變，可能與其作用位點單一有關.與大腸埃希菌耐藥靶位點突變及發(fā)生過程不同的是，環(huán)丙沙星誘導質(zhì)量濃度在32 μg/mL以下時，獲得的耐藥嗜水氣單胞菌的部分堿基先發(fā)生突變，但是其編碼的氨基酸并沒有改變，直到誘導質(zhì)量濃度達到32 μg/mL后，菌株的GyrA才發(fā)生1個氨基酸的突變.但是，隨著誘導質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，仍未有其他位點突變的發(fā)生.由此可推測在氟喹諾酮類藥物選擇壓力下，嗜水氣單胞菌對氟喹諾酮類耐藥性的增加，除了靶位點突變外，其他機制可能發(fā)揮了重要作用.

在腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等喹諾酮類耐藥機制的研究中發(fā)現(xiàn)，這些耐藥菌除了GyrA和ParC的喹諾酮類耐藥決定區(qū)的改變外，其外膜和內(nèi)膜蛋白及相關的外排泵亦經(jīng)常發(fā)生突變，而外排泵抑制劑CCCP對多種以質(zhì)子驅(qū)動力提供能量的外排泵(除依賴ATP水解驅(qū)動的ATP結(jié)合盒超家族外)的調(diào)控發(fā)揮了重要作用［12-13］.萘啶酸或環(huán)丙沙星對受試菌誘導后，非誘導的喹諾酮類藥物以及其他類藥物的敏感性均出現(xiàn)不同程度的降低，喹諾酮類藥物MIC上升的幅度比其他類藥物的高幾十甚至幾百倍，可能與喹諾酮類藥物之間結(jié)構相似有關.誘導菌株的藥敏試驗中添加CCCP后，誘導菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性存在不同程度的增加，而對萘啶酸及其他類藥物的敏感性基本沒影響，提示嗜水氣單胞菌中存在一種以氟喹諾酮類為作用底物的外排泵.當?shù)蜐舛拳h(huán)丙沙星誘導時，該外排泵起了主要作用，導致藥物在體內(nèi)蓄積減少;當環(huán)丙沙星誘導質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，細菌細胞內(nèi)吸收的藥物量大于排除的量，并且進一步促進細菌DNA的旋轉(zhuǎn)酶發(fā)生改變，從而使嗜水氣單胞菌對氟喹諾酮類耐藥性增加.而其他類藥物的MIC在誘導后增加可能與外膜通透性改變或其他類型的外排泵有關.Hernould等［14］首次報道了嗜水氣單胞菌存在引起內(nèi)源性多重耐藥的外排泵AheABC，屬于耐藥節(jié)結(jié)化細胞分化家族，其作用底物最少有13種，其中9種為抗生素，但對氟喹諾酮類無作用.至于哪一類家族的外排泵對氟喹諾酮類藥物發(fā)揮了重要作用，目前國內(nèi)外仍在探索之中，本試驗為下階段對嗜水氣單胞菌外排泵的耐藥機制研究打下了基礎.

從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在氟喹諾酮類藥物的選擇壓力下，嗜水氣單胞菌中外排系統(tǒng)、外膜通透性改變等非特異性的調(diào)節(jié)機制發(fā)揮了重要作用，減少細菌體內(nèi)的藥物蓄積;當在一定藥物濃度作用下，嗜水氣單胞菌的GyrA最容易發(fā)生突變，引起對喹諾酮類藥物低水平耐藥;隨著耐藥壓力的逐步增大，外排作用協(xié)同突變機制，令細菌對喹諾酮類的耐藥性進一步增加，使對喹諾酮類藥物的耐藥性上升到更高水平.由此可見，在臨床使用喹諾酮類藥物時，應正確選擇敏感性高的藥物并足量地使用才能達到有效的殺菌效果，并且避免長期施用某一種抗菌藥物，給藥方法不合理或者劑量不足可能是導致細菌喹諾酮類耐藥性出現(xiàn)的重要原因之一，結(jié)果將嚴重影響藥物的治療效果.

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【責任編輯柴焰】

Characterization of quinolone resistance mechanism of Aeromonas hydrophila selected in vitro

DENG Yuting1，XUE Huijuan1，2，JIANG Lan1，TAN Aiping1，WU Yali1，WANG Weili1，LUO Li1，ZHAO Fei1
(1 Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Fishery Drug Development，Ministry of Agriculture，P.R.China/Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology，Guangzhou 510380，China;2 College of Fishery and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

【Objective】To investigate the effect of the sub-inhibitory concentration of quinolones on resistance to quinolones inAeromonas hydrophilaand its mechanisms.【Method】The quinolone sensitive strains ofA.hydrophilafrom clinical and ATCC7966 were selectedin vitrostepwise exposure to increasing concentration of nalidixic acid(NAL)and ciprofloxacin(CIP)on solid medium.The quinolone resistance-determining region(QRDR)was sequenced to determine the mutation for quinolone resistance.The minimal inhibitory concentrations(MICs)of selected and non-selected antimicrobials as well as MIC by efflux pump inhibition cyanide chlorophenyl hydrazone(CCCP)of each strain were determined by broth microdilution method.The relationship between sensitivity varieties，mutations and efflux pump activitieswere analyzed.【Result and conclusion】The MICs of NAL and CIP increased 1 024-and 64 000-fold after selection，respectively，while the MICs of other antimicrobials increased diversely.When MIC of NAL or CIP inA.hydrophilareached 16 μg/mL or 32 μg/mL，Asp87→Tyr or Ser83→Arg，mutations of GyrA were identified，but no mutations of ParC were found.After CCCP was added，only MICs of fluoroquinolones caused a slight decrease，implying that it might include the quinolone mechanisms of target gene mutations and an active efflux system inA.hydrophila.

Aeromonas hydrophila;quinolone;selectionin vitro;mutation;efflux

S 511;S502

A

1001-411X(2014)01-0012-05

鄧玉婷，薛慧娟，姜蘭，等.體外誘導嗜水氣單胞菌對喹諾酮類耐藥及其耐藥機制研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2014，35(1)：12-16.

2013-02-21優(yōu)先出版時間：2013-11-07

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鄧玉婷(1982—)，女，助理研究員，博士，E-mail:fourdeng@163.com;通信作者:姜蘭(1965—)，女，研究員，碩士，E-mail:jianglan2@tom.com

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203085);廣東省魚病防治專項資金(2012年);廣東省科技計劃項目(2011B020307001)