燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)條件研究

張玉霞，趙桂琴，姚 拓，王國(guó)基，馬文文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

燕麥(Avenasativa)是一種抗逆性強(qiáng)、生產(chǎn)潛力較大、品質(zhì)優(yōu)良的世界性糧飼兼用作物，全世界已有42個(gè)國(guó)家種植燕麥，年種植面積約1 300萬(wàn)hm2，其中95%是皮燕麥。中國(guó)主要種植裸燕麥，年種植面積約為100萬(wàn)hm2，主要集中于我國(guó)華北、西北地區(qū)[1]。目前，燕麥制品的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域已經(jīng)涉及到食品、化妝品、醫(yī)藥、油脂抗氧化劑等多方面，除常見(jiàn)食品燕麥片外，還有燕麥方便食品、燕麥糕點(diǎn)和燕麥乳飲料等[2]。

散黑穗病(Ustilago)是我國(guó)燕麥產(chǎn)區(qū)發(fā)生最普遍和嚴(yán)重的真菌性病害，主要為害花器，病株始終直立，根系不發(fā)達(dá)，分蘗很少，既降低了燕麥種子產(chǎn)量，也影響秸稈的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。該病在華北、西北的一些省區(qū)，發(fā)病率通常超過(guò)10%，河北、山西、內(nèi)蒙古、甘肅等省最高發(fā)病率曾達(dá)46%～90%。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，內(nèi)蒙古全區(qū)每年糧食產(chǎn)量損失2.5×107～3.5×107kg。1981年，河北省廢保縣燕麥散黑穗病的發(fā)病面積達(dá)2.14萬(wàn)hm2，占該縣裸燕麥播種面積69.1%，其中，7 933 hm2發(fā)病率在10%～13%，全縣糧食產(chǎn)量損失1.5×106kg[4]。

燕麥散黑穗病病菌(Ustilagoavenae)以厚垣孢子附著在燕麥種子表面或以菌絲潛伏在種子與穎殼之間甚至種皮內(nèi)越冬，引起初侵染，土壤和肥料傳播的可能性較小[5]。目前，燕麥散黑穗病已成為當(dāng)前嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，甚至成為了一種毀滅性病害。冬孢子能否良好地萌發(fā)是該病害能否發(fā)生的關(guān)鍵，了解其在自然環(huán)境中的萌發(fā)適宜條件，在燕麥生產(chǎn)中盡量避免為其散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)提供相適應(yīng)的條件，可有效防止該病害的發(fā)生。燕麥冠銹、葉銹及白粉病等均被大量研究[6]，但是，該病害病原菌冬孢子萌發(fā)條件報(bào)道較少。通過(guò)測(cè)定燕麥散黑穗病菌冬孢子在不同條件下的萌發(fā)率，確定其萌發(fā)條件，可為該病害科學(xué)防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試燕麥散黑穗病菌冬孢子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘谷試驗(yàn)站提供。

1.2 方法

1.2.1 冬孢子懸浮液配制與孢子萌發(fā)統(tǒng)計(jì) 挑取少量燕麥散黑穗病菌冬孢子粉加入適量無(wú)菌蒸餾水，振蕩搖勻、使孢子團(tuán)充分散開(kāi)即制得冬孢子懸浮液。冬孢子懸浮液濃度控制在低倍鏡下可見(jiàn)病菌孢子數(shù)100。冬孢子萌發(fā)統(tǒng)計(jì)方法采用顯微鏡下檢查，淡黃色為未成熟的冬孢子，不能萌發(fā)，不予統(tǒng)計(jì)。以芽管長(zhǎng)度超過(guò)冬孢子直徑1/2作為其萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[7]。每時(shí)間段各處理檢查至少200個(gè)以上冬孢子[9]。

1.2.2 疏親水界面對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 用移液槍取冬孢子懸浮液，分別置于疏水(滅菌載玻片、燕麥葉片正面)、親水(含有水瓊脂培養(yǎng)基的表面、濕潤(rùn)的濾紙)界面上，標(biāo)記接菌點(diǎn)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于4，8，12，24 h后鏡檢冬孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率，每處理3次重復(fù)。

冬孢子萌發(fā)率(%)=[冬孢子萌發(fā)數(shù)/(冬孢子萌發(fā)數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù))]×100%[10]。

1.2.3 溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 將配制的冬孢子懸浮液分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫下保濕培養(yǎng)，分別于第4，8，12，24 h后在顯微鏡下觀察記錄冬孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次。

1.2.4 濕度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 用無(wú)菌水將冬孢子粉制成冬孢子懸浮液，置于載玻片上自然風(fēng)干，置于相對(duì)濕度(RH)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的恒溫箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，4，8 和12 h后鏡檢冬孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次。

1.2.5 光照對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 將冬孢子粉制成的孢子懸浮液懸滴于水瓊脂平板上，在25 ℃下以日光燈模擬自然光連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、光暗交替各12 h，光照8 h黑暗16 h，光照16 h黑暗8 h，培養(yǎng)24 h后，鏡檢各處理孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次。

1.2.6 pH對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉配制pH4、5、6、7、8、9的緩沖溶液，再以此溶液分別配制成對(duì)應(yīng)pH的冬孢子懸液，將各處理冬孢子懸液懸滴于水瓊脂培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于第4，8和12 h后鏡檢冬孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次[11]。

1.2.7 碳、氮源對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響 用6種碳源(1% 蔗糖、1% 葡萄糖、I% D-木糖、1% 甘露醇、l% 可溶性淀粉、1% 麥芽糖)和6種氮源(1% 乙酸銨、1% 氯化銨、1% 甘氨酸、1% 尿素、1% 蛋白胨、1% 硫酸銨)溶液制備冬孢子懸浮液，以無(wú)菌水為對(duì)照。將各處理冬孢子懸液懸滴于水瓊脂培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后鏡檢冬孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬孢子及冬孢子萌發(fā)形態(tài)

燕麥散黑穗病菌冬孢子團(tuán)黑褐色，冬孢子(圖1-A)球形或近球形，橄欖褐色。冬孢子萌發(fā)以直接產(chǎn)生芽管(圖1-B)為主，常有分枝(圖1-C)，在萌發(fā)時(shí)可以產(chǎn)生次生小孢子。

圖1 燕麥散黑穗病菌冬孢子形態(tài)(A)及萌發(fā)形態(tài)(B、C)Fig.1 Morphology of teliospores (A) and germinating teliospores (B、C) of Ustilago avenae注:A.冬孢子(10×40);B.冬孢子4 h時(shí)萌發(fā)狀態(tài)(10×40);C.冬孢子12 h時(shí)萌發(fā)狀態(tài)(10×40)

2.2 疏親水界面對(duì)燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響

散黑穗病菌冬孢子在燕麥葉片和濾紙上均不能萌發(fā)；水瓊脂培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高，4 h時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)率為19.84%；在12 h時(shí)萌發(fā)率達(dá)到76.57%(圖2)，且芽管開(kāi)始出現(xiàn)分枝。載玻片上冬孢子在12 h時(shí)的萌發(fā)率不超過(guò)5%，極顯著低于水瓊脂培養(yǎng)基的處理。結(jié)果表明，冬孢子在不同疏親水界面上萌發(fā)率差異顯著，且冬孢子萌發(fā)受親水界面的誘導(dǎo)。

2.3 不同溫度對(duì)燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響

燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)溫度范圍10～35 ℃，但低溫和高溫影響冬孢子萌發(fā)率，5，40 ℃處理下的冬孢子始終不萌發(fā)(圖3)。在10～25 ℃，冬孢子萌發(fā)率隨溫度升高而增加，25 ℃處理的冬孢子萌發(fā)率最高；低于10 ℃與高于35 ℃的各處理間冬孢子萌發(fā)率沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。在4個(gè)試驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)，4 h時(shí)冬孢子萌發(fā)率在0.94%～15.28%；8 h時(shí)，35 ℃處理的散黑穗病菌冬孢子開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)率為1.07%，25 ℃處理萌發(fā)率最高，為56.13%；12 h時(shí)，10 ℃處理下的孢子開(kāi)始萌發(fā)，20與25 ℃處理的芽管粗壯且開(kāi)始出現(xiàn)分枝，30 ℃處理的冬孢子萌發(fā)率較低，芽管細(xì)長(zhǎng)；24 h時(shí)，5 ℃處理的散黑穗病菌冬孢子開(kāi)始萌發(fā)，而25 ℃處理下其冬孢子萌發(fā)率達(dá)到91.51%。結(jié)果表明，溫度越低，散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)所需時(shí)間越長(zhǎng)。

圖2 疏親水界面下冬孢子萌發(fā)Fig.2 Effect of lyophobic and hydrophilic interface on teliospore germination

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

圖3 不同培養(yǎng)溫度下冬孢子萌發(fā)Fig.3 Effect of temperature on teliospore germination

2.4 不同濕度對(duì)燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響

冬孢子在相對(duì)濕度(RH)≤80%時(shí)始終不萌發(fā)；RH為90%的冬孢子12 h時(shí)有萌發(fā)，且萌發(fā)率均小于5%；RH為95%處理的散黑穗病菌冬孢子8 h時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，并在12 h時(shí)萌發(fā)率達(dá)到6.91%；RH為100%處理的冬孢子4 h時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，8h時(shí)萌發(fā)率超過(guò)5%，12 h時(shí)萌發(fā)率為7.84%；但整體來(lái)說(shuō)所有處理萌發(fā)率均小于10%，與水瓊脂培養(yǎng)基上冬孢子萌發(fā)率差異顯著(表1)；所有萌發(fā)的冬孢子芽管均無(wú)分枝。

表1 不同濕度處理下冬孢子萌發(fā)Table 1 Effect of humidity on teliospore germination

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.5 不同光照時(shí)間對(duì)散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響

光照8 h處理的冬孢子萌發(fā)率高于其他處理，并與其他處理存在顯著差異(圖4)；光照24 h的冬孢子萌發(fā)率僅次于光照8 h的處理，但光照24、16、12、0 h處理間的散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)率均未達(dá)到顯著差異(P>0.05)，即表明光照時(shí)間對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響不大。

圖4 不同光照處理下冬孢子萌發(fā)Fig.4 Effect of light illumination time on teliospore germination

2.6 pH對(duì)散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響

燕麥散黑穗病菌冬孢子對(duì)pH值的要求較低，在較大的pH范圍內(nèi)都能萌發(fā)，酸堿都能影響冬孢子萌發(fā)率，但酸性條件影響作用更顯著(圖5)。其中，pH為4時(shí)冬孢子萌發(fā)率最高，隨著pH的升高，冬孢子懸浮液堿性增強(qiáng)，冬孢子萌發(fā)率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，pH為9時(shí)冬孢子萌發(fā)率最低；pH為8和9時(shí)冬孢子萌發(fā)率顯著低于pH為4、5、6、7的處理(P<0.05)。由此可見(jiàn)，酸性條件有利于冬孢子萌發(fā)，而堿性條件對(duì)冬孢子萌發(fā)有抑制作用。

圖5 不同pH下冬孢子萌發(fā)Fig.5 Effect of pH on teliospore germination

2.7 不同碳、氮源對(duì)燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)的影響

在葡萄糖溶液中，散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)率高達(dá)79.38%，與可溶性淀粉及對(duì)照之間無(wú)顯著差異(表2)；D-木糖、麥芽糖、甘露醇溶液中的冬孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照，說(shuō)明此3種溶液對(duì)冬孢子萌發(fā)有抑制作用。在尿素和蛋白胨溶液中的冬孢子萌發(fā)率顯著高于對(duì)照，而甘氨酸溶液中的冬孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照，說(shuō)明不同氮源對(duì)冬孢子萌發(fā)影響各異。

表2 不同碳、氮源下冬孢子萌發(fā)Tab.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on teliospore germination

3 討論和結(jié)論

不同病菌最適培養(yǎng)條件不盡相同[8]。研究結(jié)果表明，燕麥散黑穗病菌冬孢子的萌發(fā)與外界環(huán)境條件密切相關(guān)，溫度、濕度和pH對(duì)冬孢子萌發(fā)均有直接影響。冬孢子在親水和軟水瓊脂培養(yǎng)基上具有較高的萌發(fā)率，在較親水和硬的載玻片上萌發(fā)率較低，冬孢子萌發(fā)受親水性和軟的表面的誘導(dǎo)，而徐嬋等[10]對(duì)美味黑粉菌(Ustilagoesculenta)冬孢子萌發(fā)條件研究結(jié)果是美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)受疏水界面的誘導(dǎo)，出現(xiàn)這種差異的原因可能是試驗(yàn)材料致病菌不同。

燕麥散黑穗病菌冬孢子適宜萌發(fā)溫度20～25 ℃，溫度偏高或偏低都不利于孢子萌發(fā)，與前人研究的稻粒黑粉病菌(Neovossiahorrida)[9-11]、白頭翁黑粉病菌(Urocystispulsatillae)[12]冬孢子萌發(fā)條件中溫度試驗(yàn)結(jié)果相似。冬孢子萌發(fā)對(duì)濕度的要求較高，只有在RH>90%時(shí)冬孢子才可以萌發(fā)，且萌發(fā)率不高，與樊永軍等[13]、劉正坪等[14]的研究結(jié)果一致；光照對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響不大，只有光照8 h處理的冬孢子萌發(fā)率與其他處理存在顯著差異，其他各處理之間均無(wú)顯著差異；適宜冬孢子萌發(fā)的pH為4～7，堿性條件可以抑制孢子的萌發(fā)，這一結(jié)果與前人在白頭翁黑粉病(載玻片)[12]、小麥散黑粉病(水瓊脂培養(yǎng)基)[14]和甘蔗黑穗病(載玻片)[16]上報(bào)道的結(jié)果基本一致，而陳勝軍等[11]認(rèn)為，稻粒黑粉病冬孢子在PSA培養(yǎng)基上pH為7時(shí)萌發(fā)率最高，此種差異可能是由于孢子萌發(fā)所用培養(yǎng)基和致病菌不同造成的。

最適碳源為葡萄糖，此結(jié)果與前人報(bào)道的結(jié)果不同，有學(xué)者認(rèn)為葡萄糖可以促進(jìn)蘆葦黑粉病冬孢子萌發(fā)[15]，吳偉懷等[16]認(rèn)為蔗糖對(duì)甘蔗黑穗病冬孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用大于葡萄糖，而本試驗(yàn)中的蔗糖對(duì)燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)有抑制作用，此種差異可能與菌種有關(guān)；同時(shí)，適宜燕麥散黑穗病冬孢子萌發(fā)的氮源為蛋白胨和尿素，說(shuō)明有機(jī)N素比無(wú)機(jī)N素更有利于冬孢子的萌發(fā)[13]。也有試驗(yàn)證明氮素過(guò)多能使稻粒黑粉病加重[17]。

該試驗(yàn)的散黑穗病菌冬孢子來(lái)源單一，休眠時(shí)間較短，越冬處理方式單一，是否不同地域的冬孢子萌發(fā)條件一致、休眠時(shí)間是否影響孢子萌發(fā)、燕麥病粒處理不當(dāng)是否可以促進(jìn)冬孢子萌發(fā)等問(wèn)題還有待進(jìn)一步的研究。所有冬孢子萌發(fā)試驗(yàn)都是在氧氣充足的條件下進(jìn)行，是否厭氧條件可以抑制冬孢子萌發(fā)也有待進(jìn)一步的研究。施用PGPR菌肥可促進(jìn)燕麥根長(zhǎng)、根系干重及根體積等根系性狀的改善[18]，是否可通過(guò)施用菌肥增強(qiáng)燕麥抗病能力也同樣值得一試。

燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發(fā)受親水界面的誘導(dǎo)，在水瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)率可達(dá)76.57%；適宜萌發(fā)的溫度20～25℃；對(duì)濕度要求很高，RH≥90%時(shí)開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)率<10%；光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響不明顯；最適pH為4～7，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。

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