藻類在線分析儀在海洋環(huán)境監(jiān)測中的應用研究

徐曉紅+劉桂英+宋廣軍+吳金浩+王年斌

摘要：利用藻類在線分析儀測定了3種不同微藻（鹽藻、角毛藻、金藻）的熒光值，同時采用經典方法同步測定葉綠素a濃度和細胞密度。分析結果顯示，熒光值與葉綠素a濃度、細胞密度具有顯著的正相關關系。因此，利用藻類在線分析儀能夠反映海水中微生物量的變化，也能夠反映海水中葉綠素a濃度的變化。藻類在線分析儀的應用，能夠及時掌握海水中生態(tài)環(huán)境的變化，為海域自然災害的預警提供有力的科學依據。

關鍵詞：微藻；在線監(jiān)測；葉綠素a；細胞密度

微藻生物量的測定是藻類生理生態(tài)學研究中的常規(guī)測定指標，微藻的濃度對于預測有害海藻的暴發(fā)和間接測量水樣中富營養(yǎng)化程度具有重要的作用。實驗室常用分析微藻生物量的方法很多，包括干重測定法、細胞計數法、濁度法、葉綠素a含量測定法等［1］。葉綠素a含量測定法基本采用分光光度法［2］，主要是利用分光光度計測定葉綠素a的含量，采用有機溶劑丙酮作為提取溶液。細胞計數法能夠反應微藻的生長情況，但是工作量大，費時費力，且重現性較差［3］。無論是細胞計數法還是葉綠素含量測定法，均操作繁瑣，耗費時間長，且不適用于連續(xù)監(jiān)測，不能獲得海水環(huán)境監(jiān)測的實時數據，而藻類在線分析儀監(jiān)測是基于現場結果，能夠獲取實時的連續(xù)的數據，對水體中的環(huán)境狀況及時作出判斷，為海域災害性事故-赤潮的預警和政府部門的綜合決策提供科學的依據。

本文對藻類在線分析儀測得的葉綠素熒光值與葉綠素濃a濃度、細胞密度相關性進行研究，確定藻類在線分析儀對海域水質進行實時連續(xù)監(jiān)測，能夠反映出某海域生態(tài)環(huán)境變化狀況，對赤潮早期預報提供有力的科學數據。

1材料與方法

1.1實驗材料

選取鹽藻、角毛藻、金藻作為樣品溶液，由遼寧省海洋水產科學院袁成玉研究員提供；自然海水從黑石礁附近海域采集。AOM藻類在線分析儀（捷克），751型分光光度計，TDZ-WS多管架自動平衡離心機，ZYS-200E光學顯微鏡。

1.2實驗方法

利用蒸餾水將鹽藻稀釋成7個濃度梯度，使葉綠素a濃度在0～200 μg/L之間，分別測定其葉綠素熒光值、細胞密度和葉綠素a的含量，對實驗結果進行分析。

1.2.1葉綠素熒光值利用AOM藻類在線分析儀測定，通過流過式檢測得到葉綠素熒光參數。

1.2.2細胞密度藻類樣品用具5%甲醛固定保存，樣品經過靜置、沉淀，處理后樣品使用光學顯微鏡采用個體計數法進行種類鑒定和數量統(tǒng)計，計算細胞密度。

1.2.3葉綠素a含量采用分光光度法［4］測定在一定壓力下，用醋酸纖維酯微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）對100 mL的藻液過濾，加入1 mL的碳酸鎂懸浮液，然后將濾膜折疊放入10 mL具塞離心管中，加入90%的丙酮10 mL，充分振蕩，使其溶解均勻，放置在4 ℃冰箱內提取24 h，然后用離心機在4 500 r/min下離心10 min，提取上清液于1 cm比色皿中，在波長為664，647，630和750 nm處用分光光度計測其吸光值，采用750 nm的吸光值用以校正提取液的濁度，其中以90%丙酮溶液作為參比，按Jeffrey Humphrey 的方程式得出葉綠素a的含量。

ρchl-a＝（11.85E664-1.54E647-008E630）×ｖ/（V×L）

ρchl-a——樣品中葉綠素a含量， μg/L

ｖ——樣品提取液的體積，mL

V——藻液實際用量，L

L——測定池光程，cm

2結果與分析

2.1儀器穩(wěn)定性

開啟藻類在線分析儀，待儀器穩(wěn)定之后，連續(xù)檢測同一自然海水6次，相對標準偏差為373%，多次檢測同一樣品，相對標準偏差均在5%以下，相對標準偏差越小，說明儀器越穩(wěn)定。

在波長為590 nm的條件下，分別對鹽藻溶液稀釋2倍和4倍的樣品進行檢測，其結果如圖1和圖2所示，表明儀器對不同濃度的鹽藻有不同的信號響應。

圖1590 nm下不同濃度鹽藻熒光強度

圖2590 nm測量光連續(xù)監(jiān)測不同濃度鹽藻的生物量

2.2靈敏度

對蒸餾水配制的標準藻類逐級稀釋，得到儀器與葉綠素a濃度（細胞密度）的最小響應值，確定藻類在線分析儀的檢出限。葉綠素a含量的最小檢出限濃度為30 ng/L，藻類的最小檢出限為10 cells/mL。

2.3相關性分析

2.3.1微藻葉綠素熒光值與細胞密度的相關性對鹽藻的葉綠素熒光值和細胞密度之間進行線性回歸分析，實驗結果表明，處于對數生長期的鹽藻的葉綠素熒光值與細胞密度具有良好的相關性，得到直線回歸方程，Y＝0.182 4 X＋255.27，相關系數為0.986 9(見圖3)。

2.3.2微藻葉綠素熒光值與葉綠素a含量的相關性對鹽藻的葉綠素熒光值和葉綠素a之間進行線性回歸分析，實驗結果表明，處于對數生長期的鹽藻的葉綠素熒光值與葉綠素a含量具有良好的相關性，得到直線回歸方程，Y＝104.79 X＋128.71，相關系數為0.999 1(見圖4)。

2.3.3微藻葉綠素a含量與細胞密度的相關性對鹽藻的葉綠素a含量和細胞密度之間進行線性回歸分析，實驗結果表明，處于對數生長期的鹽藻的葉綠素a含量與細胞密度具有良好的相關性，得到直線回歸方程，Y＝0.014 9 X＋2.155 5，相關系數為0.993 1(見圖5)。

圖3熒光值與細胞密度的關系圖

圖4葉綠素熒光值與葉綠素a濃度的關系

圖5細胞密度與葉綠素a濃度的關系

2.4野外監(jiān)測

藻類在線分析儀在凌水灣的監(jiān)測結果如圖6所示，表明大連凌水灣水域24 h內微藻含量基本一致，變化趨勢不明顯。利用顯微鏡進行鑒定，本海域主要藻類為中肋骨條藻、圓篩藻等。

圖6藻類在線分析儀在凌水灣的監(jiān)測結果

3討論

AOM藻類在線分析儀靈敏度高，穩(wěn)定性好，所測葉綠素熒光值與葉綠素a的含量具有正相關關系，與生物量具有正相關關系，能夠反映某海域生物量和葉綠素的變化趨勢。

藻類在線分析儀雖然能夠實時監(jiān)測數據，操作簡單，但是由于監(jiān)測原理和本身構造的缺陷，有其不足之處。首先，傳感器直接檢測的是海水中所有物種在藍光（中心波長470 nm）或者紅光（590 nm）的照射下發(fā)出的熒光。在一般情況下，大多數的熒光是由浮游植物中的葉綠素引起的，但是，存在于海水中并發(fā)熒光的物質均會被檢測〖LL〗到。因此，藻類在線分析儀是對所有的熒光物質進行定量卻不能定性，如果針對某個藻類產生的葉綠素，使用該儀器進行的葉綠素測定的準確度比實驗室單個樣品分析的準確度差。其次，如果為了獲得準確的監(jiān)測數據，需要定期地對傳感器進行校準。如果要保證所測定的是真實存在于海水中葉綠素的成份，那么只能通過實驗室萃取分析海水中葉綠素的濃度，然后用該濃度對傳感器檢測得到的數據進行校準。即使用實驗室方法測定的樣品葉綠素值對傳感器進行了校正，數據也不是很準確。因此，藻類在線分析儀主要用來檢測海水中葉綠素的變化趨勢，掌握海洋環(huán)境整體的變化情況。

參考文獻：

［1］ 沈萍萍，王朝暉，齊雨藻，等.光密度法測定微藻生物量［J］.?暨南大學學報，2001,22(3): 115-119

［2］ 蘇正淑，張憲政.幾種測定植物葉綠素含量的方法比較［J］.?植物生理學通訊，1989（5）: 77-78

［3］ 董正臻，董振芳，丁德文.快速測定藻類生物量的方法探討［J］.?海洋科學，2004,28(11): 1-5

［4］ GB17378.7-2007，《葉綠素-a的測定 分光光度法》海洋監(jiān)測規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調查和生物監(jiān)測［S］.北京：中國標準出版社，2007

The application of algae online analyzer on marine pollution

XU Xiaohong， LIU Guiying，SONG Guangjun，WU Jinhao，WANG Nianbin

（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Liaoning Dalian 116023；2. Liaoning Ocean Environment Monitoring Station， Dalian 116023）

Abstract：The fluorescent value of three microalgaes including Dunaliella salina，Chaetoceros，Chrysophyta were deter mined by algae online analyser. Compared with cell density and chlorophyll-a content, it showed good linear interrelation. So, algae online analyser can reflect the variety of microalgal biomass and chlorophyll-a content from sea water. The application of algae online analyzer can know ecology enviro nment change, which supply scientific evidence for natural disaster area warning.

Key words：microalgaes,online survey, chlorophyll-a, cell density

［2］ 蘇正淑，張憲政.幾種測定植物葉綠素含量的方法比較［J］.?植物生理學通訊，1989（5）: 77-78

［3］ 董正臻，董振芳，丁德文.快速測定藻類生物量的方法探討［J］.?海洋科學，2004,28(11): 1-5

［4］ GB17378.7-2007，《葉綠素-a的測定 分光光度法》海洋監(jiān)測規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調查和生物監(jiān)測［S］.北京：中國標準出版社，2007

The application of algae online analyzer on marine pollution

XU Xiaohong， LIU Guiying，SONG Guangjun，WU Jinhao，WANG Nianbin

（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Liaoning Dalian 116023；2. Liaoning Ocean Environment Monitoring Station， Dalian 116023）

Abstract：The fluorescent value of three microalgaes including Dunaliella salina，Chaetoceros，Chrysophyta were deter mined by algae online analyser. Compared with cell density and chlorophyll-a content, it showed good linear interrelation. So, algae online analyser can reflect the variety of microalgal biomass and chlorophyll-a content from sea water. The application of algae online analyzer can know ecology enviro nment change, which supply scientific evidence for natural disaster area warning.

Key words：microalgaes,online survey, chlorophyll-a, cell density

［2］ 蘇正淑，張憲政.幾種測定植物葉綠素含量的方法比較［J］.?植物生理學通訊，1989（5）: 77-78

［3］ 董正臻，董振芳，丁德文.快速測定藻類生物量的方法探討［J］.?海洋科學，2004,28(11): 1-5

［4］ GB17378.7-2007，《葉綠素-a的測定 分光光度法》海洋監(jiān)測規(guī)范 第7部分：近海污染生態(tài)調查和生物監(jiān)測［S］.北京：中國標準出版社，2007

The application of algae online analyzer on marine pollution

XU Xiaohong， LIU Guiying，SONG Guangjun，WU Jinhao，WANG Nianbin

（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Liaoning Dalian 116023；2. Liaoning Ocean Environment Monitoring Station， Dalian 116023）

Abstract：The fluorescent value of three microalgaes including Dunaliella salina，Chaetoceros，Chrysophyta were deter mined by algae online analyser. Compared with cell density and chlorophyll-a content, it showed good linear interrelation. So, algae online analyser can reflect the variety of microalgal biomass and chlorophyll-a content from sea water. The application of algae online analyzer can know ecology enviro nment change, which supply scientific evidence for natural disaster area warning.

Key words：microalgaes,online survey, chlorophyll-a, cell density