靶向CD151-整合素α6β1結(jié)合域的多克隆抗體的制備及初步應(yīng)用

施國(guó)明 柯愛(ài)武 俞靜嫻 胡美玉 張鵬飛 蔡加彬 董兆如 張弛 邱雙健 孫惠川 周儉 樊嘉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032)

CD151基因定位于人類染色體11p15.5，其編碼的蛋白質(zhì)形成四次跨膜分子結(jié)構(gòu)[1-8]，廣泛分布于人體各類細(xì)胞，參與細(xì)胞的多種重要生理功能[1, 7, 9]。CD151在肝細(xì)胞肝癌(肝癌)等多種惡性腫瘤中均過(guò)表達(dá)，其表達(dá)程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。CD151與整合素、生長(zhǎng)因子結(jié)合或自身相互結(jié)合而形成的功能復(fù)合體，會(huì)影響腫瘤細(xì)胞遷移、病理血管形成和上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等[1-7, 10-11]。我們的前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中CD151表達(dá)水平的改變可顯著影響肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；CD151通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)/Snail信號(hào)通路而促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP9)的分泌和表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌新生血管形成[11]；CD151與整合素α6β1在肝癌細(xì)胞表面形成復(fù)合物，進(jìn)而選擇性擴(kuò)大整合素α6β1-PI3K信號(hào)，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子Snail的核聚集與激活，以此促進(jìn)肝癌發(fā)生EMT[12]；采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, coIP)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞株HCCLM3中CD151與整合素α6β1等分子結(jié)合，形成功能復(fù)合物[13]。因此，CD151與整合素α6β1等結(jié)合形成的功能復(fù)合物是抗肝癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)[9]。本研究應(yīng)用免疫工程技術(shù)制備靶向CD151-整合素α6β1結(jié)合域[14]的多克隆抗體并鑒定其免疫學(xué)特性。

1 資料與方法

1.1 多肽合成以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 多肽復(fù)合物CGQRDHASNIYKVEG-KLH、CGQRDH ASNIYKVEG-BSA由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。6周齡的雄性BALB/c小鼠10只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。肝癌細(xì)胞株HCCLM3系復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建株并保存。

1.2 主要試劑和材料 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。小鼠抗人CD151單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Serotec公司，辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗鼠異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)熒光二抗、4-甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 靶向CD151-整合素α6β1結(jié)合域的多克隆抗體的制備 將100 μg小鼠多肽復(fù)合物CGQRDHASNIYKVEG-KLH與等量完全弗氏佐劑混合后腹腔注射BALB/c小鼠。于第3、5、7周將抗原與不完全弗氏佐劑混合并乳化后腹腔注射小鼠，抗原劑量同前。沖擊免疫后3 d處死小鼠，處死前先從眼球取血。吸取血清，4℃離心10 min，將上層血清分裝至玻璃瓶，-80℃保存。

1.4 抗體效價(jià)的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)抗體的效價(jià)。取CD151-整合素α6β1-BSA(CGQRD HASNIYKVEG- BSA)連接的抗原5 μg/mL，以100 μL/孔包被96孔ELISA酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3次，每次5 min；然后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入不同稀釋度(1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶32000、1:64000、1∶128000)的免疫后血清，37℃孵育1 h。加入1∶5000 HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，TMB顯色，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD值(450 nm)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔。將待測(cè)孔OD值≥對(duì)照孔OD值2倍者定為陽(yáng)性，以陽(yáng)性最高稀釋倍數(shù)為最終效價(jià)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blotting、細(xì)胞免疫熒光染色、免疫組織化學(xué)染色

1.5.1 Western blotting 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞，裂解后提取蛋白質(zhì)。Western blotting按常規(guī)進(jìn)行，新合成多克隆抗體按1∶1000加入，HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗按1∶5000加入，以1∶200商業(yè)化的小鼠抗人CD151單克隆抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.2 細(xì)胞免疫熒光染色 以1×104/孔的密度將HCCLM3細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)預(yù)置的蓋玻片上，常規(guī)培養(yǎng)后以4%多聚甲醛固定。按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，加入1∶200新合成的多克隆抗體，4℃過(guò)夜；加入1∶200羊抗鼠FITC熒光二抗，DAB顯色；熒光顯微鏡下觀察、攝影。

1.5.3 免疫組織化學(xué)染色 在復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所組織庫(kù)隨機(jī)抽取20例肝癌患者手術(shù)切除的肝癌組織，進(jìn)行石蠟固定后切片、烤片、脫蠟和水化、抗原熱修復(fù)、去內(nèi)源性酶、封閉，加1∶100新合成的多克隆抗體，4℃過(guò)夜，加入1∶2000 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，封片，顯微鏡下觀察、攝影。CD151陽(yáng)性染色的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié) 果

2.1 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定 免疫后的小鼠血清與抗原多肽復(fù)合物CGQRDHASNIYKVEG-KLH呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；隨著血清稀釋倍數(shù)降低，相應(yīng)的OD值隨之降低；以免疫前血清為陰性對(duì)照，經(jīng)計(jì)算多克隆抗體的效價(jià)為1∶64000。

2.2 Western blotting結(jié)果 用新合成的小鼠抗人多克隆抗體行Western blotting,檢測(cè)HCCLM3中CD151蛋白表達(dá),以商業(yè)化的小鼠抗人CD151單克隆抗體作為對(duì)照。結(jié)果顯示, 用新合成的小鼠抗人多克隆抗體反應(yīng)時(shí)，膜上28 kDa處有條帶顯示，與商業(yè)化小鼠抗人CD151單克隆抗體的條帶一致，見圖1。

2.3 細(xì)胞免疫熒光染色 采用細(xì)胞免疫熒光染色法，用新合成多克隆抗體檢測(cè)肝癌細(xì)胞HCCLM3中CD151蛋白定位。結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞HCCLM3中CD151定位于肝癌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，見圖2。

2.4 免疫組織化學(xué)染色 用新合成多克隆抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肝癌組織中CD151蛋白的定位、表達(dá)。結(jié)果顯示，CD151陽(yáng)性表達(dá)于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿，CD151在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，見圖3。

A：新合成多克隆抗體；B：商業(yè)化的小鼠抗人CD151單克隆抗體

圖1用新合成多克隆抗體行Westernblotting,檢測(cè)肝癌細(xì)胞HCCLM3中CD151蛋白表達(dá)

A 肝癌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈CD151陽(yáng)性表達(dá)；B 細(xì)胞核DAPI染色；C 圖片A和B融合后

A 癌旁組織中CD151的表達(dá)(×400)；B 癌與癌旁組織交界處CD151的表達(dá)(×100)；C 癌組織中CD151的表達(dá) (×400)

3 討 論

目前已知，許多基因參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展，且一些基因在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。CD151是四跨膜蛋白家族中最重要的成員之一，它在人體細(xì)胞中分布廣泛，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板等，參與細(xì)胞的多種重要生理功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞移動(dòng)與形態(tài)改變等[1, 7, 9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CD151可通過(guò)多種途徑促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，包括(1)影響肝癌細(xì)胞的侵襲性[10]；(2)通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信號(hào)通路促進(jìn)MMP9的分泌和表達(dá)，促進(jìn)肝癌新生血管形成[11]；(3)與整合素α6β1在肝癌細(xì)胞表面形成復(fù)合物，選擇性擴(kuò)大整合素α6β1/PI3K信號(hào)，促進(jìn)肝癌發(fā)生EMT[12]等。因此，CD151是影響肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵蛋白，與整合素α6β1等結(jié)合所形成的功能復(fù)合體是抗腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)[9]。

已有抗人CD151抗體用于腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道[15]。但這些研究在制備抗體時(shí)未考慮到CD151在腫瘤侵襲中所發(fā)揮的作用需依賴四跨膜蛋白功能復(fù)合體(四跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò))，故這些研究制得的單克隆抗體在抑制腫瘤侵襲的同時(shí)也嚴(yán)重影響了CD151的其他重要功能。本研究合成的多克隆抗體與肝癌細(xì)胞和肝癌組織都能較好地結(jié)合，且僅針對(duì)CD151-整合素α6β1復(fù)合體的結(jié)合域，故不影響CD151對(duì)機(jī)體的其他功能。今后，有必要進(jìn)一步評(píng)估本研究合成的多克隆抗體在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的功能。

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