珍稀瀕危植物珙桐初代培養(yǎng)研究

植 爽，胡 艷，曹 婧，肖小君,2*，陳文年,2

(1.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641112；2.四川省高等學(xué)校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641112)

珍稀瀕危植物珙桐初代培養(yǎng)研究

植 爽1，胡 艷1，曹 婧1，肖小君1,2*，陳文年1,2

(1.內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641112；2.四川省高等學(xué)校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641112)

以珙桐芽體為試材，采用WPM、1/2 MS、B5三種基本培養(yǎng)基，附加6-BA、NAA、GA34因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)研究了不同外植體消毒時(shí)間、剝離方式、芽體長(zhǎng)度對(duì)珙桐初代培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：用75%酒精30 s+0.1% HgCl220 min消毒效果較好，外植體長(zhǎng)度大于0.5 cm，剝離芽體至剩余鱗片葉1～2個(gè)的處理方式有利于降低污染率，最佳芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為：WPM+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L + AC 0.5 g/L。

珙桐；誘導(dǎo)；外植體；初代培養(yǎng)

珙桐(DavidainvolucrataBaill.)，又名鴿子樹，為我國(guó)特有的珍稀孑遺植物，被列為國(guó)家Ⅰ級(jí)瀕危保護(hù)植物，具有極高的觀賞價(jià)值和研究?jī)r(jià)值[1]。然而，珙桐的種子殼厚而堅(jiān)硬，有后熟現(xiàn)象，休眠期長(zhǎng)，發(fā)芽率低，繁殖和引種困難，所以至今未成為廣泛應(yīng)用的園林綠化樹種[2]。近年來由于人類活動(dòng)對(duì)自然環(huán)境的影響，珙桐的生態(tài)環(huán)境遭到了嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致其個(gè)體數(shù)量逐漸減少，分布范圍也日益縮小，因此挽救和保護(hù)珙桐并擴(kuò)大其數(shù)量迫在眉睫。采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行珙桐再生體系的建立可為保護(hù)珙桐種質(zhì)資源提供一條新途徑，目前關(guān)于這方面的研究主要集中在愈傷組織的誘導(dǎo)[3-5]，種胚離體培養(yǎng)[6-8]，帶芽莖段[9-10]或冬芽[11]誘導(dǎo)叢生芽增殖，總的來說有關(guān)珙桐植株再生的文獻(xiàn)報(bào)道較少，且進(jìn)展緩慢，初代培養(yǎng)的重復(fù)性差。為此，本試驗(yàn)對(duì)外植體不同消毒時(shí)間、剝離方式、芽體長(zhǎng)度、激素配比和基本培養(yǎng)基的篩選等方面做了系統(tǒng)研究，有效降低了外植體的污染率，為珙桐高效離體再生體系的建立提供初代培養(yǎng)的理論依據(jù)，以期最終為珙桐的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2013年7月，在四川省宜賓市珙縣選取當(dāng)年生枝條上未萌發(fā)的芽體作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度的篩選 本試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，基本培養(yǎng)基為WPM、1/2 MS、B5，附加細(xì)胞分裂素6-BA 3水平分別為1.0，2.0，3.0 mg/L，生長(zhǎng)素NAA 3水平分別為0.05，0.1，0.2 mg/L，赤霉素GA33水平分別為0，2.0，5.0 mg/L。其中含蔗糖30 g/L，瓊脂粉4.6 g/L，活性炭0.5 g/L，調(diào)節(jié)pH值為5.8～6.0，高壓滅菌20 min( 121 ℃) 后備用。

將珙桐芽放在洗衣粉溶液中浸泡2 min，用干凈的白紗布輕輕將芽鱗擦干凈，再在流水下沖洗2 h后在超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精溶液浸泡20 s，經(jīng)無菌水沖洗3次，再用0.1%HgCl2溶液浸泡15 min，經(jīng)無菌水沖洗5～6次。用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，剝?nèi)ト垦亏[片，留絨狀未展開葉2～3片，去除與莖連接處的木質(zhì)部接入培養(yǎng)基，選取芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基配方用于以下試驗(yàn)。

1.2.2 外植體不同消毒時(shí)間、剝離方式及長(zhǎng)度對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響 在基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度的篩選基礎(chǔ)上，設(shè)置外植體消毒時(shí)間分別為75%酒精30 s+0.1% HgCl2(10，20，30 min)；剝離方式分別為：①不剝芽鱗片，②剝?nèi)ゲ糠峙c消毒液接觸的芽鱗片，③將芽鱗片全部剝掉，剩絨狀葉2～3個(gè)；外植體長(zhǎng)度分別為①d>1 cm，②0.5 cm

1.3 培養(yǎng)條件

將接種后的材料置于培養(yǎng)室內(nèi)，先暗處理2 d，此后每日光照14 h，光照度為2 000 lx，溫度控制在(25±2) ℃，以上每個(gè)處理均接種10管，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

定期觀察外植體污染、褐化、萌發(fā)及芽的生長(zhǎng)情況并記錄數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度對(duì)珙桐芽誘導(dǎo)的影響

從結(jié)果(見表1)可以看出，基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度對(duì)珙桐芽誘導(dǎo)有明顯影響。WPM與1/2 MS明顯優(yōu)于B5培養(yǎng)基，低質(zhì)量濃度的6-BA及 NAA效果好于高質(zhì)量濃度，GA3質(zhì)量濃度越高芽體啟動(dòng)越早，生長(zhǎng)速度越快，鄒利娟等[11]研究表明在培養(yǎng)中適當(dāng)添加GA3能促進(jìn)芽苗生長(zhǎng)，葉片擴(kuò)大，縮短培養(yǎng)時(shí)間。但本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)GA3對(duì)芽體長(zhǎng)勢(shì)影響較大，在GA3的作用下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，芽的生長(zhǎng)更容易發(fā)生畸形化，且質(zhì)量濃度越高，畸形化程度越嚴(yán)重，出現(xiàn)披針形葉，葉片顏色出現(xiàn)紅色或紫紅色。觀察發(fā)現(xiàn)30 d后未添加GA3的培養(yǎng)基中新生葉片廣卵圓形，綠色，完全展開且長(zhǎng)勢(shì)旺盛。直觀分析結(jié)果表明：4種因素的極差(R值)大小依次是C>A>B>D，因此4種因素對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響大小依次是NAA>基本培養(yǎng)基>6-BA>GA3，從均值(K)可以看出，使用WPM培養(yǎng)基配合低質(zhì)量濃度的6-BA及 NAA有利于珙桐的芽誘導(dǎo)，即最佳配方為WPM+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L。

表1 珙桐芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

“+”表示葉片完全卷曲;“++” 表示葉片較為卷曲;“+++”表示葉片完全舒展開。

2.2 外植體不同消毒時(shí)間對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響

從結(jié)果(見表2)可知，用75%酒精與0.1%HgCl2的不同消毒時(shí)間處理外植體的效果差異顯著，其中75%酒精30 s+0.1%HgCl210 min的污染率最高達(dá)96.67%，且芽一直未萌發(fā)，隨著HgCl2溶液浸泡時(shí)間的加長(zhǎng)，污染率有所降低，但處理30 min外植體受消毒劑毒害作用加大，表現(xiàn)為芽生長(zhǎng)速度緩慢且長(zhǎng)勢(shì)差，而處理20 min的珙桐芽啟動(dòng)早，20 d即可觀察到外植體開始長(zhǎng)出新葉片，且葉片深綠色，長(zhǎng)勢(shì)好，芽誘導(dǎo)率最高達(dá)76.92%。

表2 外植體不同消毒時(shí)間對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同外植體剝離方式對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響

從結(jié)果(見表3)可以看出，不同的剝離方式對(duì)珙桐芽的成功誘導(dǎo)有顯著影響。未經(jīng)任何處理的芽體幾乎全部污染，剩余鱗片1～2個(gè)與剩絨葉狀1～2個(gè)剝離方式的污染率和誘導(dǎo)率均存在顯著差異，觀察發(fā)現(xiàn)后者芽啟動(dòng)早，10 d后即長(zhǎng)出新葉片，生長(zhǎng)情況良好，但污染率較前者高出36.67%。綜合試驗(yàn)結(jié)果，分析認(rèn)為剩余鱗片1～2個(gè)的剝離方式有利于珙桐芽體萌發(fā)，25 d左右可見新葉片長(zhǎng)出，且污染率最低，誘導(dǎo)率高達(dá)78.26%。

2.4 不同外植體長(zhǎng)度對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響

從結(jié)果(見表4)可以看出，外植體長(zhǎng)度d<0.5 cm時(shí)，珙桐的芽誘導(dǎo)率為0，且污染率高達(dá)90%，分析認(rèn)為由于外植體太小，剝離比較困難，在空氣中操作時(shí)間較長(zhǎng)，從而引起污染，且芽體太小不易成活。當(dāng)d>0.5 cm時(shí)，污染率顯著降低，誘導(dǎo)率最高達(dá)75%，外植體越大，新葉片展開速度越快，芽體長(zhǎng)勢(shì)好，啟動(dòng)快。

表3 不同外植體剝離方式對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表4 不同外植體大小對(duì)珙桐芽體萌發(fā)的影響

同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體的選擇及處理方式對(duì)珙桐芽誘導(dǎo)的影響

珙桐為多年生木本植物，母株帶菌多，污染嚴(yán)重，取材困難，外植體的遺傳和生理差異使初次培養(yǎng)的可重復(fù)性降低，初次培養(yǎng)的嚴(yán)重污染及酚類物質(zhì)的氧化使培養(yǎng)難以進(jìn)行[12]。在組織培養(yǎng)中，外植體的選擇及處理是組織培養(yǎng)能否成功的第1步[13]。綜合本試驗(yàn)研究結(jié)果認(rèn)為，用75%酒精30 s+0.1%HgCl2處理20 min消毒效果較好，常規(guī)滅菌劑在材料表面消毒的同時(shí)對(duì)植物組織往往亦有傷害，0.1%HgCl2處理30 min后對(duì)珙桐污染率可以有效控制，但誘導(dǎo)率顯著下降，且芽體受傷害嚴(yán)重，表現(xiàn)為啟動(dòng)慢，死亡率高，而處理10 min的污染率較高，未達(dá)到消毒效果。選取外植體長(zhǎng)度大于0.5 cm且剝離芽體至剩余鱗片葉1～2個(gè)的處理方式有利于控制污染，這可能是因?yàn)橥庵搀w較大，在剝離與消毒劑接觸的芽鱗片時(shí)操作較容易，技術(shù)更熟練，減少了外植體在空氣中的暴露機(jī)會(huì)，從而降低了污染率。

3.2 基本培養(yǎng)基及激素質(zhì)量濃度對(duì)珙桐芽誘導(dǎo)的影響

在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的鹽濃度對(duì)外植體褐變和試管苗玻璃化均有一定影響[14]。本試驗(yàn)研究認(rèn)為，珙桐的初代培養(yǎng)中選用WPM和1/2MS培養(yǎng)基效果較好，這與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致[4,15]，符合多數(shù)木本植物在誘導(dǎo)階段采用較低無機(jī)鹽濃度的結(jié)論。而B5培養(yǎng)基由于含有高濃度的硝態(tài)氮和低濃度的鈣鹽，可能會(huì)抑制珙桐的芽誘導(dǎo)。

植物激素的種類、質(zhì)量濃度和配比對(duì)組織培養(yǎng)的器官形成起著重要的作用。本試驗(yàn)研究表明，各種激素的影響力大小依次為NAA>6-BA>GA3，這可能由于本試驗(yàn)采取材料的時(shí)間為夏季，珙桐芽體未進(jìn)入休眠狀態(tài)，用低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素NAA和細(xì)胞分裂素6-BA即可促進(jìn)芽體萌發(fā)生長(zhǎng)，同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)GA3能促進(jìn)芽體提早啟動(dòng)并伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，但隨著質(zhì)量濃度的增加，畸形化形象嚴(yán)重，變異增多，這可能與激素物質(zhì)抑制過氧化氫酶和過氧化物酶的活性或抑制糖酵解過程有關(guān)[16]。因此，在珙桐的初代培養(yǎng)過程中，GA3的最佳促進(jìn)芽萌發(fā)質(zhì)量濃度還需進(jìn)一步研究。綜合試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為WPM+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L+AC 0.5 g/L，為珙桐組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

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InitialculturestudyofendangeredplantDavidiainvolucrataBaill.invitromicropropagation

ZHI Shuang1, HU Yan1, CAO Jing1, XIAO Xiao-jun1,2*, CHEN Wen-nian1,2

(1.School of Life Sciences, Neijiang Normal University, Neijiang 641112,China; 2.Key Laboratory of Colleges and Universities in Sichuan for Research and Utilization of Distinctive Agricultural Undertakings, Neijiang 641112,China)

Using basal medium of WPM,1/2MS and B5 which added 6-BA,NAA and GA3, the time of different explant disinfection, the way of stripping and the length of buds ofDavidiainvolucratawere studied.The results showed that the disinfection effect was appropriate by adopting 75% alcohol for 30 and 0.1% HgCl2for 20 min, it was good for reducing pollution to us the explants which were more than 0.5 cm and the stripping way to the rest 1 to 2 scale leaves.And the best medium for buds induction was WPM+ 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L + AC 0.5 g/L.

DavidiainvolucrataBaill.;Induction;Explant; Initial culture

1001-7380(2014)04-0029-04

2014-05-03

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310640010)；內(nèi)江師范學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)項(xiàng)目(12NJZ04)；內(nèi)江市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12109)；內(nèi)江師范學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目(13NSD-76)

植 爽(1992-)，女，四川都江堰人，大學(xué)本科畢業(yè)，研究方向：植物組織培養(yǎng)。

*通信作者：肖小君(1982- )，女，四川岳池人，助理研究員，碩士，研究方向：植物組織培養(yǎng)及生理生化。

S792.99；Q943.1

A

10.3969/j.issn.1001-7380.2014.04.007