子宮內(nèi)膜樣癌中SIAH2的表達及臨床意義

甄 娟，劉玉東，宋春紅，吳 莎，焦瑞芬

子宮內(nèi)膜癌是一種常見的女性惡性腫瘤，位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位，全球每年新確診患者約319 600例。子宮內(nèi)膜癌最常見的病理類型為子宮內(nèi)膜樣癌，約占總病例的85%[1-2]。隨著臨床診療水平的提高，早期(Ⅰ/Ⅱ期)子宮內(nèi)膜樣癌患者在接受手術(shù)和輔助化療后的5年生存率可達85%，但晚期(Ⅲ/Ⅳ期)患者的治療效果仍不容樂觀，5年生存率僅達15%[3]。近年針對基因改變的靶向治療在惡性腫瘤的治療中由于效果顯著和副作用小，逐漸成為一些惡性腫瘤的主要治療方法。因此，識別并鑒定子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)基因，不僅有助于預(yù)測腫瘤的生物學(xué)行為以及評估患者的預(yù)后，而且也有利于臨床開發(fā)診斷相關(guān)基因的靶向治療方案，從而提高患者的生存率和延長患者的生存時間。SIAH2作為一種E3泛素連接酶，研究發(fā)現(xiàn)其在卵巢上皮性癌和乳腺癌等女性惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用，與患者預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。目前，SIAH2在子宮內(nèi)膜樣癌中的研究和作用尚不明確。本文旨在探討SIAH2在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達及臨床意義，評估其在子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月～2020年1月河北省石家莊市第四醫(yī)院婦科行診斷性刮宮和手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜標(biāo)本206例，其中癌旁正常子宮內(nèi)膜40例，子宮內(nèi)膜非典型增生50例，子宮內(nèi)膜樣癌116例，所有患者術(shù)前均未接受放、化療及其他治療。病理診斷結(jié)果根據(jù)WHO(2014)子宮內(nèi)膜腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)明確診斷。組織離體后取少量立即放入液氮后移入-80 ℃冰箱保存，以備qRT-PCR和Western blot檢測。所有標(biāo)本的使用均通過本院倫理委員會審核及患者知情同意。

1.2 試劑免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑，均購自福州邁新公司。Fast Quant RT Kit試劑盒購自天根生化公司，GO Taq qPCR Master Mix試劑盒購自Promega公司，PCR引物合成委托上海生工公司進行。鼠抗人SIAH2抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色，標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。按試劑盒說明書步驟進行染色，SIAH2(抗體濃度1 ∶200)，PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。染色結(jié)果由兩名有經(jīng)驗的中級以上病理醫(yī)師閱片審核，SIAH2蛋白在細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機選取5個高倍視野(400×)，每個視野計數(shù)200個腫瘤細胞。(1)按陽性細胞百分比計分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。(2)按細胞著色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。將上述兩項得分結(jié)果相乘：<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.3.2qRT-PCR 采用qRT-PCR法對SIAH2 mRNA進行定量檢測。采用Trizol試劑提取30對子宮內(nèi)膜樣癌及癌旁正常子宮內(nèi)膜組織總RNA，利用Fast Quant RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在ABI 7500上利用GO Taq qPCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR分析，實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。SIAH2 PCR引物序列：上游5′-AGCATCAGGAACCT GGCTAT-3′；下游5′-CTGGTTTCTCCGTATGGTGC-3′。內(nèi)參18S PCR引物序列：上游5′-CGCCGCTAGAGG TGAAATTC-3′；下游5′-CCAGTCGGCATCGTTTAT GG-3′。

1.3.3Western blot法 采用Western blot法檢測SIAH2蛋白定量。收集30例子宮內(nèi)膜樣癌及30例配對的癌旁正常子宮內(nèi)膜組織，加入裂解液，粉碎勻質(zhì)后，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清即為總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉2 h，抗SIAH2(1 ∶150)、抗β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育過夜，ECL發(fā)光。Image J軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度值作為相對表達量。實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4 隨訪采用患者門診復(fù)查及電話隨訪，平均每6個月1次，開始時間為手術(shù)時間，終止時間為患者死亡時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法。定量資料采用t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗比較總生存率的組間差異。Cox比例風(fēng)險模型篩選子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織中SIAH2的表達SIAH2陽性定位于細胞核(圖1)。在癌旁正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜非典型增生及子宮內(nèi)膜樣癌組織中，SIAH2陽性率分別為7.50%(3/40)、42.00%(21/50)和74.14%(86/116)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=56.524，P<0.001)。SIAH2表達與子宮內(nèi)膜樣癌FIGO分期、肌層浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡和組織學(xué)分級無關(guān)(P>0.05，表1)。

圖1 SIAH2在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達，SP法；A.癌旁正常子宮內(nèi)膜組織中SIAH2呈陰性；B.子宮內(nèi)膜非典型增生組織中部分細胞SIAH2呈核陽性；C.子宮內(nèi)膜樣癌中SIAH2呈彌漫強陽性

表1 子宮內(nèi)膜樣癌中SIAH2的表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 子宮內(nèi)膜樣癌中SIAH2的表達qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與30對癌旁正常子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜樣癌組織中SIAH2 mRNA和蛋白的相對表達量均明顯升高。mRNA相對表達量分別為21.38±0.76、23.74±0.97，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-10.541，P<0.001，圖2A)；蛋白相對表達量分別為0.25±0.05、0.92±0.10，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-24.912，P<0.001，圖2B)。

圖2 SIAH2在癌旁正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣癌組織中的表達：A.qRT-PCR檢測，***P<0.001；B.Western blot法檢測；N1、N2：癌旁正常子宮內(nèi)膜組織；C1、C2：子宮內(nèi)膜樣癌組織

2.3 SIAH2表達與子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后的關(guān)系生存分析結(jié)果顯示，SIAH2陽性和陰性患者的5年平均生存時間分別為44、56個月；5年中位生存時間分別為54、60個月。SIAH2陽性患者的生存時間顯著低于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.129，P<0.001)，單因素分析結(jié)果表明，SIAH2表達、FIGO分期(χ2=9.406，P=0.002)、肌層浸潤深度(χ2=6.209，P=0.013)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.633，P=0.003)與子宮內(nèi)膜樣癌患者的總生存期相關(guān)(表2，圖3)；Cox多因素分析結(jié)果顯示，SIAH2陽性也是子宮內(nèi)膜樣癌患者預(yù)后差的獨立危險因素(表3)。

圖3 Kaplan-Meier分析子宮內(nèi)膜樣癌臨床病理因素與患者總生存率的關(guān)系：A.SIAH2表達；B.肌層浸潤深度；C.FIGO分期；D.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

表2 子宮內(nèi)膜樣癌總生存率的單因素分析

表3 子宮內(nèi)膜樣癌總生存率的多因素分析

3 討論

近年子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率急劇上升。惡性腫瘤的早期準(zhǔn)確診斷對于癌癥患者的治療和預(yù)后至關(guān)重要[6-7]。因此，尋找子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過程中相關(guān)基因的改變，既有助于該疾病的早期診斷，也為未來的靶向治療提供靶點。

E3泛素連接酶SIAH與果蠅屬SINA的氨基酸同源性達83%以上，其生物學(xué)活性對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至關(guān)重要。果蠅SINA及其人類同源的SIAH1和SIAH2蛋白具有4個高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，屬于RING結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶家族。這些結(jié)構(gòu)域包括環(huán)RING結(jié)構(gòu)域(E3泛素連接酶活性的催化活性位點)、SIAH型鋅指(SZF，包含一個雙鋅指基序)、SBS(底物結(jié)合位點)和二聚結(jié)構(gòu)域(二聚化)。SINA/SIAH1/SIAH2作為一種E3連接酶，能夠相互作用、修飾和靶向作用于多種底物，協(xié)調(diào)泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)復(fù)合體的組裝、蛋白質(zhì)的亞細胞定位以及其他人類正常發(fā)育和疾病中細胞的功能。SIAH2作為該家族的重要成員，具有高度發(fā)散和擴展的N端序列，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、低氧反應(yīng)、線粒體生物合成、細胞生存、多種腫瘤的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮重要的促進作用[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)SIAH2在喉鱗狀細胞癌中高表達，隨著腫瘤分化程度的降低和臨床分期的升高，SIAH2的表達顯著增加，并且SIAH2的表達與喉鱗狀細胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)[12]。Qi等[13]在鼠黑色素瘤中研究發(fā)現(xiàn)，抑制SIAH2活性后，通過上調(diào)底物蛋白Spry2降低P-ERK的表達，或通過PHD3降低HIF-1α表達，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞凋亡。Ahmed等[14]在4種肺癌細胞系中亦發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SIAH2-shRNA抑制SIAH2表達后，通過降低P-ERK的表達抑制肺癌細胞的生長和增殖，促進肺癌細胞凋亡，軟瓊脂菌落形成實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，抑制SIAH2后，肺癌A549細胞形成菌落的大小和數(shù)量明顯減少，細胞凋亡增加；動物實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，敲低SIAH2表達后裸鼠原發(fā)腫瘤的體積和重量顯著降低；提示SIAH2與細胞增殖凋亡密切相關(guān)。Schmidt等[15]發(fā)現(xiàn)，抑制SIAH2的表達可抑制Ras介導(dǎo)的成纖維細胞的惡性轉(zhuǎn)化及裸鼠胰腺癌細胞的生長，而且在兩種含有致癌K-Ras基因的胰腺癌細胞系中，SIAH2的缺失導(dǎo)致P-ERK的表達降低，推測SIAH2或SIAH2的底物蛋白有可能是人胰腺癌細胞Ras/Raf/ERK/MAPK信號通路調(diào)節(jié)反饋環(huán)的一部分。SIAH2通過干擾Ras信號通路，從而抑制腫瘤的生長和增殖。

本實驗發(fā)現(xiàn)，SIAH2蛋白的陽性率在癌旁正常子宮內(nèi)膜→子宮內(nèi)膜非典型增生→子宮內(nèi)膜樣癌組織中逐漸升高，SIAH2 mRNA和蛋白相對表達量在子宮內(nèi)膜樣癌中也明顯增高，提示在子宮內(nèi)膜樣癌癌變過程中，SIAH2可能作為腫瘤促進因子發(fā)揮作用。同時實驗結(jié)果亦顯示，SIAH2表達與子宮內(nèi)膜樣癌FIGO分期、肌層浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示SIAH2與子宮內(nèi)膜樣癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，SIAH2陽性患者較陰性患者的5年生存率明顯下降，生存時間也明顯縮短。Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)，SIAH2是子宮內(nèi)膜樣癌患者的危險因素，提示SIAH2可能與子宮內(nèi)膜樣癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，SIAH2作為癌基因在子宮內(nèi)膜樣癌生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，高表達的SIAH2與子宮內(nèi)膜樣癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等惡性行為及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，SIAH2有望成為子宮內(nèi)膜樣癌早期診斷標(biāo)志物和潛在的藥物治療靶點，并為臨床評估患者預(yù)后提供理論依據(jù)。