瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)患者血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究

陳 春，侯 煒，林 雷，楊 鵬，侯 俊，湯和青，方 為，柯齊斌

(1. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)病毒研究所，湖北 武漢，430071;2. 宜昌市中心人民醫(yī)院 麻醉科，湖北 宜昌，443003)

體外循環(huán)中血液與體外循環(huán)機(jī)裝置的接觸、溫度變化，血流方式改變(非搏動(dòng)性灌注)，血液中各種血細(xì)胞成分的激活和組織缺血/再灌注損傷過程均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的激活或損傷，并有學(xué)者認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞激活或損傷是體外循環(huán)致全身炎癥反應(yīng)和多系統(tǒng)臟器功能損傷的重要環(huán)節(jié)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEs)被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)因素[2]，VEs從組織血管表面脫落至外周血液中，成為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs)。CECs是目前活體內(nèi)可以特異地、直接地反映血管損傷的指標(biāo)。減輕體外循環(huán)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,是促進(jìn)體外循環(huán)后患者近期恢復(fù)和提高遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵。瑞芬太尼與其他阿片受體激動(dòng)劑的不同點(diǎn)在于其N酞基端存在酯鍵，使其更易被酯酶分解，代謝基本不受血漿膽堿酯酶和抗膽堿酯酶藥物的影響，藥物作用的消退主要是由于藥物的快速清除而不是再分布所致，因此不會(huì)發(fā)生諸如芬太尼、阿芬太尼、舒芬太尼等較長(zhǎng)時(shí)間靜脈輸注后產(chǎn)生的藥物蓄積問題。瑞芬太尼作為鎮(zhèn)痛型阿片為基礎(chǔ)的麻醉將成為新的趨勢(shì)，目前有關(guān)瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響尚未見研究報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組方法

經(jīng)三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選擇醫(yī)院2010年8月—2012年8月?lián)衿谠隗w外循環(huán)下行二尖瓣置換術(shù)患者40例，美國(guó)麻醉師協(xié)會(huì)(ASA)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ，年齡37～62歲?；加袗盒阅[瘤、肝腎功能障礙、服用免疫抑制劑、細(xì)胞毒性藥物、激素替代治療的患者除外?；颊咴谛g(shù)前1周停用阿司匹林及華法林，無使用肝素者。將患者隨機(jī)分組，分別于術(shù)中接受瑞芬太尼預(yù)處理組(Ⅰ組)和對(duì)照組(Ⅱ組)?；颊呔炇鹬橥鈺?，手術(shù)由心胸外科同一主任醫(yī)師主刀完成。

1.2 麻醉及手術(shù)

在全麻低溫心肺轉(zhuǎn)流下手術(shù)。手術(shù)患者的麻醉誘導(dǎo)采用咪唑安定0.05 mg/kg，芬太尼0.01 mg/kg,依托咪酯0.3 mg/kg，維庫(kù)溴銨0.15 mg/kg，術(shù)中持續(xù)輸注芬太尼、丙泊酚和維庫(kù)溴胺維持麻醉。Ⅰ組在CPB前4 μg/(kg·min)的速率靜脈輸注瑞芬太尼5 min，間隔5 min后重復(fù)給藥，共3次；Ⅱ組輸注等容量的生理鹽水。所有患者均采用STOCKERT-Ⅲ型心肺轉(zhuǎn)流機(jī)，西京膜式氧合器，無血預(yù)充，4∶1氧合血冷晶體停搏液間斷灌注。體外循環(huán)(CPB)過程中所有患者肝素用量為3 mg/kg，預(yù)充液中10 mg/L,激活凝血時(shí)間(ACT)維持在480～600 s，轉(zhuǎn)流完畢用魚精蛋白中和體內(nèi)殘余肝素，比例為1∶1。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)

所有入選患者均于在CPB前(T1)，CPB 30 min(T2)，體外循環(huán)停機(jī)后0 h(T3)、6 h(T4)，24 h(T5)，72 h(T6)各采集中心靜脈血5 mL。采用免疫磁珠法分離和計(jì)數(shù)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)外周循環(huán)血內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的變化。生物試劑采用抗鼠IgG磁珠(Dynal M-450，Norway)和鼠抗人CD146單克隆抗體(Biocytex，Marseilles，F(xiàn)rance); 按廠家說明在磁架上進(jìn)行磁珠清洗、重懸磁珠以及與抗CD146單克隆抗體混合，最終使用PBS/BSA將其終濃度為1.4×108個(gè)磁珠/mL。取1 mL全血，加入20 μL清洗過的抗-CD146磁珠抗體，4 ℃旋轉(zhuǎn)輕搖孵育30 min。加入等體積的緩沖液，置于磁架上2 min，吸棄液體后剩下磁珠結(jié)合的細(xì)胞，按說明重復(fù)洗滌4次，再用100 μL緩沖液重懸磁珠結(jié)合的細(xì)胞，用吖啶橙染色，在倒置相差熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。另取3.6 mL中心靜脈血，加入含有0.4 mL枸櫞酸鈉的塑料試管中混勻，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上層血漿儲(chǔ)存于-20 ℃待測(cè)。vWF、TM采用雙抗夾心法(ELISA法)，操作按說明書進(jìn)行。同時(shí)測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的Hct。NO試劑盒利用硝酸還原酶將特異性將NO3-還原為NO2-，用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。ET-1試劑盒用γ放射免疫計(jì)數(shù)器測(cè)內(nèi)皮素含量。CPB期間血液稀釋對(duì)測(cè)定值的影響用以下公式校正：校正值=測(cè)定值×轉(zhuǎn)流前Hct/測(cè)定時(shí)Hct。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

本實(shí)驗(yàn)2組患者未出現(xiàn)各種原因退出實(shí)驗(yàn)的情況，術(shù)后無1例手術(shù)死亡。2組患者年齡、性別、體質(zhì)量、主動(dòng)脈阻斷時(shí)間均無顯著差異，見表1。

表1

2.2 CECs的測(cè)定

2組患者在CPB前比較，CECs無顯著差異，但在T3、T4、T5、T6，Ⅱ組CECs數(shù)量明顯高于Ⅰ組(P<0.05)，見表2。

表2 圍術(shù)期循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量 cells/μL

2.3 TM、vWF比較

與術(shù)前比較，2組變化趨勢(shì)一致，TM、vWF在CPB開始后30 min時(shí)已顯著升高，至CPB結(jié)束時(shí)達(dá)到峰值，而后有下降趨勢(shì)，直至停CPB后72 h恢復(fù)到CPB前水平。2組間比較，在CPB結(jié)束后的T3、T4、T5時(shí)間點(diǎn)，Ⅰ組的TM 、vWF濃度均較Ⅱ組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)TM 、vWF檢測(cè)結(jié)果

2.4 NO、ET-1比較

隨著CPB開始，兩組患者ET-1濃度顯著升高，到CPB停機(jī)后的72 h恢復(fù)到術(shù)前水平。2組間比較，Ⅰ組ET-1濃度在T2、T3、T4、T5均較Ⅱ組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NO的血漿濃度僅在Ⅱ組T3、T4兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)較CPB前有所降低，后又恢復(fù)正常。組間比較中，Ⅰ組NO濃度在T4、T5兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯高于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組患者不同時(shí)間點(diǎn)NO、ET-1檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

3.1 CPB對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害

內(nèi)皮細(xì)胞在血液和組織表面是非常活躍，在正常血液分布、凝血、炎癥反應(yīng)和損傷方面具有決定性的作用[3]。體外循環(huán)中溫度變化，血流方式改變，血液中各種血細(xì)胞成分的激活和組織缺血/再灌注損傷過程均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的激活或損傷。血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)是細(xì)胞表面的凝血酶受體，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜表面,當(dāng)機(jī)體VEC損傷時(shí)，TM從VEC表面脫落入血,引起血漿TM水平的升高。因此，血漿TM的濃度增加是VEC損傷的可靠指標(biāo)。VEC上的TM是維持血管表面抗凝特性的重要成分，由于CPB致VEC上的TM脫落入血,血管表面抗凝功能下降，導(dǎo)致凝血，消耗凝血因子。內(nèi)皮細(xì)胞是血管性假血友病因子(vWF)的主要來源[4]。vWF的主要功能是促進(jìn)血小板與血管壁的黏附，從而促進(jìn)血栓的形成。在CPB中，當(dāng)CPB所致的VEC損傷/活化，使vWF大量釋放，與活化面的血小板表面vWF結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，使大量血小板相互黏附沉積于CPB管道、損傷的管壁中，導(dǎo)致血小板消耗。血中vWF水平可以反映血管內(nèi)皮細(xì)胞激活或損傷的程度[5]。

3.2 瑞芬太尼預(yù)處理與VEC

阿片類受體種類很多，而分布于心血管系統(tǒng)的主要是μ、δ和κ三種受體，人體血管壁上主要是κ和μ受體占優(yōu)勢(shì)。瑞芬太尼是一種高度選擇性μ受體激動(dòng)劑，但同時(shí)對(duì)κ和δ受體也具有輕微的親和力。國(guó)內(nèi)外研究表明，瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)期間的心肺腦等重要器官的缺血-再灌注損傷均有保護(hù)作用。本研究以生理鹽水作為對(duì)照組，瑞芬太尼作為實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，在體外循環(huán)結(jié)束的72 h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組的CECs數(shù)目減少，反映血管內(nèi)皮細(xì)胞自組織血管表面脫落進(jìn)入外周血液中的較少，間接證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)皮細(xì)胞受損程度較對(duì)照組輕。CPB結(jié)束后的各時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組TM 、vWF濃度均較對(duì)照組低，直至停CPB后72 h恢復(fù)到CPB前水平。TM 、vWF濃度的升高反映VEC受損程度的指標(biāo)，更進(jìn)一步證實(shí)了瑞芬太尼預(yù)處理對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。兩個(gè)觀察指標(biāo)結(jié)果均在CPB開始后升高，CPB結(jié)束達(dá)到高峰，隨著時(shí)間的推移后逐漸降低。兩指標(biāo)在時(shí)間點(diǎn)上的同步性，更進(jìn)一步從側(cè)面證實(shí)了兩個(gè)指標(biāo)反映VEC受損的一定程度的可行性和準(zhǔn)確性。Hofbauer等經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)瑞芬太尼能夠抑制中性粒細(xì)胞經(jīng)單層內(nèi)皮細(xì)胞移位、中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)[6]。而且瑞芬太尼既可通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)來舒張血管，又可通過抑制電壓敏感性鈣離子通道產(chǎn)生非內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張作用[7-10]。這些都可能是瑞芬太尼預(yù)處理體內(nèi)發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)的作用機(jī)制。

3.3 CPB致VEC分泌NO、ET-1平衡失調(diào)

ET是目前所知的最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)。正常VEC表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞型NO合酶(eNOS),其合成和釋放的NO通過激活血管平滑肌細(xì)胞GTP轉(zhuǎn)變?yōu)閏GMP，發(fā)揮強(qiáng)有力的松弛血管效應(yīng)。VEC損傷/活化可下調(diào)eNOS的基因表達(dá)，使NO合成減少[11]，而CPB所致的炎癥遞質(zhì)和內(nèi)毒素可導(dǎo)致NO的釋放增加。本研究證實(shí)瑞芬太尼預(yù)處理能夠明顯減少縮血管物質(zhì)ET-1的產(chǎn)生，僅在T4、T5兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯增加NO舒張血管物質(zhì)。這可能是該時(shí)間點(diǎn)內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)表達(dá)達(dá)到高峰所致，也可能與eNOS表達(dá)下調(diào)和iNOS的激活不平衡有關(guān)。在CPB手術(shù)中，阻斷升主動(dòng)脈將不可避免出現(xiàn)缺血-再灌注損傷，推測(cè)在復(fù)跳后早期可能存在VEC損傷所致的NO合成和分泌下降的情況。本實(shí)驗(yàn)Ⅰ組NO濃度變化不明顯，可能是存在瑞芬太尼預(yù)處理增加NO的合成所代償。

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