維生素C對靜脈鐵劑誘導的外周血單個核細胞凋亡的干預作用

張紅強，李丹妮，陳 建

(重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院 腎內(nèi)科 血液凈化中心，重慶，400037)

鐵缺乏在慢性腎臟病患者，特別是接受維持性血液透析(MHD)的患者中很常見，是導致腎性貧血的重要原因之一。而腎性貧血是促進慢性腎衰竭進展、增加心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率及病死率的重要危險因素[1]。靜脈鐵劑和口服鐵劑都能改善這種鐵缺乏狀態(tài)，且前者療效更顯著，副作用小，臨床用藥相對方便，所以靜脈鐵劑的臨床應用更為廣泛[2-3]。但是二者都會加重MHD患者體內(nèi)的氧化應激狀態(tài)，進而加劇微炎癥狀態(tài)[4]、感染、心血管并發(fā)癥[5]等的發(fā)生。已有臨床報道[6]稱口服或靜脈補充維C[7]都可以減輕補鐵劑誘導的MHD患者氧化應激狀態(tài)。

HPBMC即外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞，發(fā)揮細胞免疫功能。HPBMC易被細胞因子和線粒體氧化損傷激活，進而ROS生成量增多并發(fā)生凋亡，這是造成MHD患者外周血免疫細胞數(shù)量減少，免疫功能缺陷的重要原因之一[8]。在進行MHD治療時常用靜脈鐵劑來糾正患者鐵缺乏，增加鐵儲備，研究發(fā)現(xiàn)這同時也發(fā)現(xiàn)其會加重MHD患者體內(nèi)的氧化應激狀態(tài)[9]。這是否跟靜脈鐵劑對MHD患者外周血單核細胞(HPBMC)氧化應激加劇和細胞凋亡的影響有關(guān)尚不清楚，因此本研究使用靜脈鐵劑處理體外培養(yǎng)的MHD患者HPBMC，并使用維C進行干預，探索靜脈鐵劑對HPBMC的氧化應激和細胞凋亡的影響以及維C對此的干預作用。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與試劑

流式細胞儀(BD FACS ARIA，美國)，Western blot成像儀(Carestream Health，美國)，多功能酶標儀(Beckman Coulter，美國)，4種靜脈鐵劑(西南藥業(yè)，重慶)，維生素C注射液(雙鶴藥業(yè)，北京)，單個核細胞分離液(灝洋生物科技，天津)，RPMI 1 640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，Bax、Bcl-2一抗(Santa Cruz，美國)，HRP標記山羊抗兔二抗、Caspase-3的活性檢測試劑盒(碧云天，江蘇海門)，ROS Fluorescent Probe-DHE(Sigma，美國)，Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(三箭生物科技，天津)。

1.2 HPBMC的分離與培養(yǎng)

取10 mL肝素鈉抗凝外周靜脈血按血：分離液按1∶2的比例緩慢注入人淋巴細胞分離液上層，400 g 20 ℃離心30 min，取白膜層細胞重懸于4倍體積的RPMI 1 640中，200 g，10 min離心洗細胞，重復2次。按1×106個/mL的濃度將細胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1 640培養(yǎng)基中，加入植物血凝素(PHA)至終濃度300 μg/mL。

1.3 試驗分組與處理

按照上述方法培養(yǎng)24 h，然后更換為不含PHA的1 640培養(yǎng)液，分為對照組，Is處理組，Id處理組，F(xiàn)g處理組，F(xiàn)c處理組，Id+維C干預組。4種靜脈鐵劑的濃度均為200 μg/mL，維C的終濃度為25 μmol/L。對照組給予1640培養(yǎng)基，Is、Id、Fg、Fc處理組分別給予含對應靜脈鐵劑的1 640培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 h; Id+維C干預組先給予含Id的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，再加入維C繼續(xù)培養(yǎng)至6 h。收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞凋亡率的檢測

使用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率：收集細胞用孵育緩沖液洗滌1次，800 r/min離心5 min。用100 μL孵育緩沖液重懸細胞，加入5 μL FITC標記的抗Annexin V抗體，室溫下避光孵育10 min后加入5 μL PI染色5 min，染色結(jié)束后加入500 μL PBS以終止反應并上機檢測。

1.5 Western blot實驗

收集的細胞用RIPA 細胞裂解液裂解，超聲破碎后用12 000 g離心10 min，收集上清采用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品與5X蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃金屬浴5 min。配制并灌注12%的分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣蛋白30 μg左右。80 V (30 min)，120 V (90 min)的電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，300 mA (60 min)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h以上，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌10 min 2次，加入HRP標記二抗室溫孵育2 h。再次TBXT 洗滌10 min 2次，ECL發(fā)光顯影。分別檢測Bax和Bcl-2，以及蛋白質(zhì)上樣內(nèi)參GAPDH的表達。結(jié)果用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)進行條帶的灰度分析。

1.6 Caspase-3的活性檢測

按照碧云天的Caspase-3的活性檢測試劑盒(C1115)說明書進行實驗。

1.7 細胞ROS陽性率的檢測

收集細胞，重懸細胞于孵育緩沖液中，加入ROS Fluorescent Probe-DHE至終濃度為2 μM，并置于37 ℃避光孵育15 min。孵育緩沖液洗滌細胞1次，800 r/min離心5 min，加入400 μL PBS重懸細胞并上機檢測。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果

① 不同靜脈鐵劑對HPBMC細胞凋亡的影響: 4種靜脈鐵劑處理組的細胞凋亡率分別是Is (42.38±2.74)%，Id (40.51±2.13)%，F(xiàn)g (41.79±2.82)%，F(xiàn)c (40.47±1.97)%，均明顯高于對照組(20.13±1.16)%(P<0.01)，且4組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1; ② 維C干預對Id誘導的HPBMC細胞凋亡的作用: Id+維C干預組的細胞凋率為(29.09±1.29)%，明顯低于Id處理組(40.51±2.13)%(P<0.05)。見表1。

2.2 Western blot分析結(jié)果

① Id對HPBMC促凋亡基因Bax，以及抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達的影響(圖1): 采用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)分析雜交條帶的灰度值，結(jié)果顯示：Id處理組的Bax，Bcl-2蛋白表達量分別是對照組的(2.09±0.21)，(0.46±0.11)倍，(P<0.05); ② 維C干預對Id誘導Bax和Bcl-2蛋白表達的作用(圖1): Id+維C干預組的Bax，Bcl-2蛋白表達量分別是對照組的(1.13±0.25)，(0.87±0.16)倍，維C干預降低了凋亡基因Bax的表達，增加了抗凋亡基因Bcl-2的表達，(P<0.05)。

表1 不同靜脈鐵劑對HPBMC細胞凋亡率的影響及維C的干預作用 %

與CTRL比較，*P<0.05；與Id比較，#P<0.05。

2.3 Caspase-3的活性檢測結(jié)果

① Id對HPBMC凋亡分子Caspase-3活性的影響(圖2): 測得各組405 nm吸光度值后，與對照組相比，結(jié)果顯示：Id處理組的Caspase-3活性是對照組的(3.51±0.33)倍(P<0.05); ②維C干預對Id誘導的Caspase-3活化的作用(圖2): Id+維C干預組的Caspase-3活性是對照組的(1.87±0.26)倍，維C干預降低了凋亡分子Caspase-3的活性(P<0.05)。

2.4 流式細胞儀檢測HPBMC細胞ROS陽性率的結(jié)果

① Id對HPBMC細胞ROS陽性率的影響(圖3): Id處理組的細胞ROS陽性率為(68.32±4.57)%，明顯高于對照組(42.87±4.05)%(P<0.05); ② 維C干預對Id誘導的細胞ROS生成量增加的作用(圖3): Id+維C干預組的細胞ROS陽性率為(53.79±4.11)%，明顯低于Id處理組(68.32±4.57)%(P<0.05)。

圖2 Id對HPBMC凋亡分子Caspase-3的影響及維C的干預作用

3 討 論

鐵是十分重要的微量元素，參與構(gòu)成多種活性酶，也是血紅蛋白中O2的載體。但是MHD患者由于攝入不足、透析過程中丟失、胃腸道慢性失血等原因，常出現(xiàn)缺鐵性貧血[10]，因而臨床上常采用靜脈鐵劑給其補鐵。但是靜脈補鐵后，體內(nèi)游離鐵增加，通過Fenton /Haber-Weiss反應催化產(chǎn)生代表ROS的羥基和烷氧基，觸發(fā)脂質(zhì)過氧化，引起氧化應激反應加劇，促進微炎癥狀態(tài)，感染等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[11-12]。臨床研究[13]發(fā)現(xiàn)，口服或靜脈補充維C，以及使用維C透析液都可以減輕補鐵劑誘導的MHD患者氧化應激狀態(tài)。目前，靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激以及使用抗氧化劑維C對此進行干預都體現(xiàn)在患者體內(nèi)氧化應激一系列指標的改變上，尚沒有做深入研究。本研究采用體外培養(yǎng)的MHD患者HPBMC，探索靜脈鐵劑對其凋亡的影響以及維C對此過程的干預作用，欲探索靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激，促進微炎癥狀態(tài)，感染等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制是否與HPMBC的凋亡有關(guān)。

A為對照組; B為Id處理組; C為Id+維C干預組

HPMBC主要包括T、B淋巴細胞及少量單核細胞，其增殖與凋亡之間的動態(tài)平衡是維持人體正常防御與監(jiān)視功能的保證。研究[14]發(fā)現(xiàn)，HPBMC的凋亡與MHD患者細胞免疫功能缺陷密切聯(lián)系。細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，凋亡早期，位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸(PS)可遷移至細胞外側(cè)， Annexin V可與PS發(fā)生特異性結(jié)合，是目前流式細胞定量檢測細胞凋亡的首選方法。本研究采用此法發(fā)現(xiàn)4種靜脈鐵劑處理的MHD患者HPMBC后，其凋亡率顯著高于對照組(表1)，證實靜脈鐵劑可誘導MHD患者HPMBC的凋亡，與文獻[15]報道相一致。進一步采用Western blotting分析法和Casepase-3活性檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)靜脈鐵劑Id處理的HPBMC細胞促凋亡因子Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少(圖1)，凋亡分子Casepase-3被激活(圖2)，說明靜脈鐵劑處理會激活HPBMC細胞內(nèi)的凋亡信號。這些結(jié)果都證實，靜脈鐵劑能夠誘導MHD 患者HPBMC的細胞凋亡。

作為免疫細胞，HPBMC易被細胞因子和線粒體氧化損傷所激活，ROS生成量增多，凋亡信號激活，進而發(fā)生凋亡，這提示靜脈鐵劑對HPBMC凋亡的誘導可能與其促進細胞氧化應激和線粒體氧化損傷有關(guān)。故本研究探索了靜脈鐵劑對HPBMC細胞ROS生成量的影響，F(xiàn)CM檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Id處理的HPBMC細胞ROS陽性率明顯高于對照組(圖3)，證實了靜脈鐵劑能加劇HPBMC的氧化損傷程度。鑒于維C在臨床上用于改善靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激狀態(tài)，本研究進一步探索了維C對靜脈鐵劑誘導的HPBMC的氧化應激和細胞凋亡的干預作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)維C干預能使Id處理的HPBMC細胞促凋亡因子Bax表達下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加(圖1)，凋亡分子Casepase-3活性下降(圖2)，ROS生成量減少(圖3)，最終抑制了靜脈鐵劑Id誘導的HPBMC細胞凋亡。因此(表1)，本研究在體外驗證了抗氧化劑維C能減輕靜脈鐵劑Id誘導的MHD患者HPBMC的ROS生成和細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實靜脈鐵劑能加劇體外培養(yǎng)的MHD患者HPBMC細胞的氧化應激狀態(tài)，并誘導細胞凋亡，維生素C對此的干預作用也與臨床報道相符。這可能是靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激，促進微炎癥狀態(tài)，感染等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制之一。

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