不同劑量致敏原對(duì)小鼠過(guò)敏性哮喘模型特異性抗體和炎性細(xì)胞因子的影響

胡德建，張香梅

(山東省濰坊市人民醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 濰坊，261041)

過(guò)敏性哮喘是由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的、由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等參與的變態(tài)反應(yīng)性疾病。研究[1-2]表明，過(guò)敏性哮喘發(fā)作時(shí)，患者IgE水平顯著升高。有學(xué)者報(bào)道，不同劑量的過(guò)敏原會(huì)引發(fā)機(jī)體輔助性T細(xì)胞(Th)向Th1和Th2分化的不同趨勢(shì)，從而影響其臨床結(jié)局[3-4]。本研究觀察不同劑量的致敏原對(duì)過(guò)敏性哮喘模型小鼠血清特異性抗體IgE、IgG2a和白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、γ-干擾素(IFN-γ)等炎性細(xì)胞因子的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源及分組

雌性BALB小鼠45只，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，平均(22.36±1.08) g，均購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。45只小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組10只，低劑量組12只，中劑量組11只，高劑量組12只。

1.2 主要儀器與試劑

超聲霧化器購(gòu)自上海四菱醫(yī)療器械廠，雞卵蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清(FBS)及PBS緩沖液均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，ELISA試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 造模方法

分別將10、100、1000 μg的OVA溶于含40 mg氫氧化鋁、pH值7.4的200 μL PBS緩沖液中，各組于第0、7、14天分別進(jìn)行腹腔注射：空白對(duì)照組注射不含OVA的PBS緩沖液200 μL，其余3組分別注射上述含不同劑量OVA的PBS緩沖液200 μL。第15～20天內(nèi)將小鼠置于霧化吸入箱內(nèi)進(jìn)行霧化激發(fā)致敏，通過(guò)超聲霧化發(fā)生器霧化吸入5%的OVA生理鹽水溶液，20 min/(次·d)，共處理6 d。小鼠出現(xiàn)呼吸急促、口唇紫疳、煩躁不安、行動(dòng)遲緩、腹肌痙攣及大小便失禁等癥狀即為造模成功[5]。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 IgE、IgG2a含量檢測(cè)：最后一次霧化激發(fā)致敏24 h后，取各組小鼠眼內(nèi)眥靜脈血，離心后取血清，以ELISA試劑盒檢測(cè)特異性抗體IgE、IgG2a含量。

1.4.2 細(xì)胞因子檢測(cè)：取血后處死小鼠，取出脾臟，在金屬網(wǎng)上磨碎，離心后取細(xì)胞沉淀，懸于加有10%FBS的RPMI培養(yǎng)液(100 a U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)中制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每只小鼠細(xì)胞培養(yǎng)2孔，1孔加入200 mg/L的OVA，1孔設(shè)為空白對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)24 h后，收集上清液置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)，以ELISA法檢測(cè)血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ的含量。

1.4.3 肺組織病理標(biāo)本制作：小鼠處死后取右肺門至邊緣處3 mm厚度的組織標(biāo)本，以15%甲醛固定，石蠟包埋切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.5 觀察指標(biāo)

觀察各組小鼠肺組織病理變化、血清特異性抗體IgE、IgG2a水平及血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ水平差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺組織病理變化

空白對(duì)照組肺組織無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，各給藥組均出現(xiàn)不同程度炎細(xì)胞浸潤(rùn)，低劑量組最為顯著，鏡下可見(jiàn)上皮細(xì)胞斷裂或脫落，杯狀細(xì)胞增生，血管壁水腫，支氣管壁增厚，周圍見(jiàn)大量以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。中、高劑量組炎癥反應(yīng)依次減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織病理圖 (HE染色)

2.2 各組血清特異性抗體水平比較

低、中、高劑量組IgE水平呈遞減趨勢(shì)，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.01); 各實(shí)驗(yàn)組血清IgG2a水平呈遞增趨勢(shì)，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清特異性抗體水平比較±s) pg/mL

2.3 各組血清細(xì)胞因子水平比較

低、中、高劑量組血清IL-4、IL-5水平呈遞減趨勢(shì)，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；各實(shí)驗(yàn)組血清IL-12及IFN-γ水平呈遞增趨勢(shì)，組間差異顯著(P<0.01)，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清IL-4、IL-5、IL-12及IFN-γ水平比較±s) pg/mL

3 討 論

最早、最經(jīng)典的過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型是通過(guò)豚鼠制備，但由于相應(yīng)檢測(cè)試劑較為缺乏，限制了其廣泛應(yīng)用，而小鼠試劑來(lái)源廣泛，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用相對(duì)低廉，近年來(lái)逐步地應(yīng)用于建立哮喘模型[6-7]。

過(guò)敏性哮喘是一種以多種炎癥細(xì)胞和/或細(xì)胞因子浸潤(rùn)、IgE升高、肺部組織結(jié)構(gòu)重塑以及氣道反應(yīng)性增高為特征的慢性氣道炎癥，屬于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)。當(dāng)致敏原進(jìn)入機(jī)體，CD4+Th2細(xì)胞和B細(xì)胞被激活，產(chǎn)生特異性IgE[8]，后者與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)；當(dāng)相同的致敏原再次激發(fā)時(shí)，肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞就會(huì)釋放大量炎性介質(zhì)，誘發(fā)機(jī)體生理功能紊亂，疾病發(fā)作。

目前認(rèn)為，Th1/Th2細(xì)胞平衡紊亂，Th1細(xì)胞朝向Th2細(xì)胞分化，IgE含量增加是過(guò)敏性哮喘發(fā)作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9-10]。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5等多種細(xì)胞因子，而IL-4可誘導(dǎo)B細(xì)胞的Ig類別轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致IgE增加，IgE既能啟動(dòng)速發(fā)相過(guò)敏反應(yīng)，也可誘發(fā)遲發(fā)相過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)過(guò)敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用; IL-5則具有趨化嗜酸性粒細(xì)胞聚集的作用，而嗜酸性粒細(xì)胞是參與炎癥浸潤(rùn)的主要效應(yīng)細(xì)胞，可加速氣道組織結(jié)構(gòu)的破壞，這些炎癥細(xì)胞和促炎性細(xì)胞因子共同引發(fā)或促進(jìn)呼吸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。Th2細(xì)胞則可分泌IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子，抑制Th2型細(xì)胞因子的促炎作用，抑制致敏原引發(fā)的過(guò)敏作用。成功的免疫治療可有效降低IgE水平，誘導(dǎo)B細(xì)胞在合成免疫球蛋白時(shí)由IgE向IgG轉(zhuǎn)化，而IgG作為抗體可捕獲抗原，與之形成抗原-抗體復(fù)合物，從而緩解過(guò)敏癥狀[11]。當(dāng)小鼠在致敏原作用下出現(xiàn)Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，IgE含量增加，而Th1型細(xì)胞因子含量降低的趨勢(shì)時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出過(guò)敏性哮喘表型，即造模成功。

盡管個(gè)體暴露于致敏原下是過(guò)敏性哮喘發(fā)作的始動(dòng)環(huán)節(jié)，但研究發(fā)現(xiàn)對(duì)過(guò)敏性患者重復(fù)給予大濃度致敏原的免疫治療可能誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫耐受，患者體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平下降，從而實(shí)現(xiàn)哮喘逆轉(zhuǎn)[12]。因此，掌握恰當(dāng)?shù)闹旅粼瓭舛纫源_保小鼠模型能真實(shí)表現(xiàn)出過(guò)敏性哮喘的臨床特征，又不致產(chǎn)生免疫耐受是建立哮喘模型的關(guān)鍵問(wèn)題。商艷等[4]采用不同劑量的OVA致敏激發(fā)小鼠，制備過(guò)敏性哮喘模型，結(jié)果表明，低劑量組(10 μg OVA)小鼠肺部炎癥表現(xiàn)最明顯，支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞含量及血清IgE水平顯著高于對(duì)照組及其他各劑量組。湛孝東等[13]采用7種不同濃度的致敏原制備小鼠模型，結(jié)果表明，低濃度OVA連續(xù)致敏的小鼠肺部病理改變最為顯著，高濃度OVA造模的效果較差。

本研究結(jié)果表明，低劑量組小鼠的肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)最明顯，且血清IgE、IL-4、IL-5水平顯著高于對(duì)照組及中、高濃度組，提示10 μg可能是OVA激發(fā)致敏制備過(guò)敏性哮喘小鼠模型的合適劑量；隨著OVA濃度增加，小鼠血清IgE、IL-4、IL-5水平逐步下降，而血清IgG2a、IL-12及IFN-γ水平逐步增加，提示高濃度的OVA可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)致敏原免疫耐受，造模效果下降，與上述報(bào)道基本一致。

[1] Busse W W，Morgan W J，Gergen P J，et al. Randomized trial of omalizumab (anti-IgE) for asthma in inner-city children[J]. New England Journal of Medicine，2011，364(11): 1005.

[2] Jin C，Shelburne C P，Li G，et al. Particulate allergens potentiate allergic asthma in mice through sustained IgE-mediated mast cell activation[J]. The Journal of clinical investigation，2011，121(3): 941.

[3] Huang X，Tang L，Wang F，et al. Astragaloside IV attenuates allergic inflammation by regulation Th1/Th2 cytokine and enhancement CD4+CD25+Foxp3 T cells in ovalbumin-induced asthma[J]. Immunobiology，2014，219(7): 565.

[4] 商艷，李強(qiáng)，黃怡，等. 不同劑量致敏原對(duì)小鼠過(guò)敏性哮喘模型的影響[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(1): 69.

[5] 樊衛(wèi)文，楊志軍，孫濱，等. 過(guò)敏性哮喘大鼠大腦和肺組織 c-fos 蛋白的表達(dá)[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24(8): 469.

[6] Arnold I C，Dehzad N，Reuter S，et al. Helicobacter pylori infection prevents allergic asthma in mouse models through the induction of regulatory T cells[J]. The Journal of clinical investigation，2011，121(8): 3088.

[7] Ather J L，Ckless K，Martin R，et al. Serum amyloid A activates the NLRP3 inflammasome and promotes Th17 allergic asthma in mice[J]. The Journal of Immunology，2011，187(1): 64.

[8] 吳靜，胡東，李朝品，等. 細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)粉塵螨誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺部炎癥的免疫調(diào)節(jié)[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2007，27(12): 1132.

[9] Abrahamsson T R，Sandberg Abelius M，F(xiàn)orsberg A，et al. A Th1/Th2 associated chemokine imbalance during infancy in children developing eczema，wheeze and sensitization[J]. Clinical & Experimental Allergy，2011，41(12): 1729.

[10] Zhao Y，Yang J，Gao Y D. Altered expressions of helper T cell (Th) 1，Th2，and Th17 cytokines in CD8+and γδ T cells in patients with allergic asthma[J]. Journal of Asthma，2011，48(5): 429.

[11] 李雅莉，孫秀珍，張潔，等. 霜天蛾過(guò)敏性哮喘患者特異性免疫治療的效果評(píng)價(jià)[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版，2003，24(3): 237.

[12] Tarzi M，Klunker S，Texier C，et al. Induction of interleukin 10 and suppressor of cytokine signalling 3 gene expression following peptide immunotherapy[J]. Clinical & Experimental Allergy，2006，36(4): 465.

[13] 湛孝東，姜玉新，李良懌，等. 不同濃度卵蛋白變應(yīng)原對(duì)小鼠哮喘模型建立的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20(4): 16.