抑制KIF14表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性

李曉娜，韓 雪，楊 濤，王紅磊，高鵬志，趙 瑋(.河北省體育科學(xué)研究所普通外科，河北 石家莊 0500；.河北省石家莊市第一醫(yī)院普通外科，河北 石家莊 0500)

·論著·

抑制KIF14表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性

李曉娜1，韓 雪1，楊 濤2，王紅磊2，高鵬志2，趙 瑋2
(1.河北省體育科學(xué)研究所普通外科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院普通外科，河北 石家莊 050011)

目的通過抑制肝癌細(xì)胞中KIF14表達(dá)，觀察紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。方法應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，肝癌細(xì)胞中沉默KIF14表達(dá)，在經(jīng)紫杉醇處理細(xì)胞后采用MTT試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果肝癌細(xì)胞中沉默KIF14的表達(dá)可以增強(qiáng)其對(duì)紫杉醇的敏感性。結(jié)論KIF14在肝癌細(xì)胞耐藥發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制可以為尋找克服肝癌耐藥的有效途徑提供理論依據(jù)。

肝腫瘤；驅(qū)動(dòng)蛋白；抗腫瘤藥

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.08.007

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其中43.7%的病例發(fā)生在我國，嚴(yán)重威脅著我國人民的生命健康[1]。目前，針對(duì)HCC的治療，仍以手術(shù)為首選，然而HCC放療不敏感及其對(duì)化療藥物的強(qiáng)耐藥性，導(dǎo)致HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移快[1]。有研究[2]表明，腫瘤年病死率中與腫瘤耐藥相關(guān)的占90%以上。紫杉醇在腫瘤化療中已被廣泛應(yīng)用，在多數(shù)腫瘤的臨床治療中取得了良好的效果，并得到臨床醫(yī)生的認(rèn)可[3]，但是由于HCC的強(qiáng)耐藥性，使紫杉醇在HCC治療中的效果不令人滿意。腫瘤耐藥是一個(gè)多因素參與、多基因異常表達(dá)的復(fù)雜過程，驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員KIF14是以細(xì)胞內(nèi)微管為軌道的動(dòng)力蛋白[4-5]，KIF14在HCC組織中異常過表達(dá)，并可能參與了HCC的耐藥過程。本研究通過抑制肝癌細(xì)胞中KIF14表達(dá)，觀察紫杉醇對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，旨在揭示KIF14在肝癌耐藥發(fā)生過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC7721購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司，紫杉醇購自江蘇恒瑞制藥有限公司。MTT試劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，pGCsiU6/Neo/GFP載體購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司(Genechem)。

1.2 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC7721正常傳代，常規(guī)置于10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合的DMEM培養(yǎng)基中，37℃,5%CO2加濕空氣培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞株建立：通過在pGCsiU6/Neo/GFP質(zhì)粒序列載體(Genechem)中插入合成雙鏈寡居核苷酸(KIF14:5′TTCCCGATCTCATTCAGTT-TTTTCAAGAGAAAACTGAATGAGATCGGGAA或非沉默:5′TTCTCCGAACGTTTCTATCTTTTCAAGAGAAGATAGAAACGTTCGGAGAA3′)建立小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)表達(dá)載體。采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，根據(jù)Lipofectamine-2000試劑要求進(jìn)行，用熒光標(biāo)記梯度濃度的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和HepG2，轉(zhuǎn)染后置37℃ 5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h，加入濃度為800mg/L的G418(Calbiochem)進(jìn)行篩選，得到4個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞系繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)培養(yǎng)陰性對(duì)照組。

1.4 不同濃度紫杉醇處理后肝癌細(xì)胞增殖變化：分別選擇對(duì)數(shù)生長期的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞及沉默KIF14的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，常規(guī)消化后，于96孔板中每孔加入1×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入100μL含紫杉醇3、6、12、24、48mg/L的培養(yǎng)液。細(xì)胞對(duì)照組每孔分別加入不含紫杉醇的培養(yǎng)液100μL，空白對(duì)照組每孔分別加入不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)液。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37℃,5%CO2加濕空氣培養(yǎng)。48h后每孔加入濃度為5g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲亞砜(dimethysulfoxide,DMSO)100μL，充分振蕩后酶標(biāo)儀測(cè)量各孔吸光度值(OD570)。依據(jù)下面的公式計(jì)算細(xì)胞的抑制率(inhibitionratio,IR)=(細(xì)胞對(duì)照組OD570-實(shí)驗(yàn)組OD570)/(細(xì)胞對(duì)照組OD570-空白對(duì)照組OD570)×100%，并根據(jù)藥物濃度繪制抑制率曲線。

1.5 沉默KIF14表達(dá)的操作：應(yīng)用哺乳動(dòng)物載體介導(dǎo)的RNA干擾切除肝癌細(xì)胞鏈中KIF14的表達(dá)的HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株。將KIF14基因編碼區(qū)的一對(duì)寡核苷酸靶向1 701～1 721bp合成并插入pGCsiU6/Neo/GFPsiRNA表達(dá)載體。肝癌細(xì)胞帶著KIF14siRNA表達(dá)或控制載體轉(zhuǎn)染。G418篩選后，獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

2 結(jié) 果

應(yīng)用MTT法檢測(cè)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其相應(yīng)的親本細(xì)胞耐藥性，與親本細(xì)胞株相比，各轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在不同濃度的紫杉醇作用下，細(xì)胞抑制率均明顯升高(P<0.01)。見表1，2。

GroupsPaclitaxelconcentrations3μmol/L6μmol/L12μmol/L24μmol/L48μmol/LHepG210．87±1．2025．04±2．0640．21±1．6762．26±1．4271．29±1．58HepG2/siRNA20．87±2．1045．30±2．5770．33±2．5290．28±1．7096．08±1．87 t19．02064．66061．636172．998118．965 P0．0030．0000．0000．0000．000

Groups Paclitaxelconcentrations3μmol/L6μmol/L12μmol/L24μmol/L48μmol/LSMMC?772110．34±1．4926．99±2．0142．24±1．6561．73±1．6170．35±1．84SMMC?7721/siRNA27．23±1．5648．66±1．5372．09±1．8682．99±2．0296．96±2．05 t61．63664．684205．82177．271114．955 P0．0000．0000．0000．0000．000

3 討 論

驅(qū)動(dòng)蛋白是以細(xì)胞內(nèi)微管為軌道的動(dòng)力蛋白。此類蛋白在許多細(xì)胞進(jìn)程，如mRNA和蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞有絲分裂、信號(hào)傳導(dǎo)、減數(shù)分裂、微管多聚體的運(yùn)動(dòng)學(xué)控制中起重要作用[4-5]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員KIF14是具有6 586個(gè)堿基對(duì)的10cDNA克隆[6]。像所有驅(qū)動(dòng)蛋白一樣，KIF14是微管依賴分子馬達(dá)，包括一個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白域和一個(gè)叉頭關(guān)聯(lián)域[7]，同時(shí)KIF14還包含C端香木緣激酶綁定域和N端蛋白調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂綁定域，使KIF14在胞質(zhì)分裂、HeLa細(xì)胞中KIF14枯竭致雙核細(xì)胞生成和細(xì)胞凋亡中扮演重要角色[8-9]。

KIF14在一些腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中起著重要作用[7,10]，并且可能參與了腫瘤對(duì)化療藥物耐藥的發(fā)生過程。為了解并分析KIF14在肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥過程中的作用，我們選取肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721進(jìn)行研究，首先應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，沉默肝癌細(xì)胞株中KIF14的表達(dá)，通過MTT的方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默KIF14的表達(dá)可明顯增加肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。提示KIF14可以增加肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性。

總之，本研究選取2株肝癌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過siRNA干擾技術(shù)，建立穩(wěn)定的沉默KIF14的肝癌細(xì)胞系，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)KIF14在肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥過程中發(fā)揮著重要作用。那么，KIF14的具體作用機(jī)制是什么？是否還有其他機(jī)制共同參與了肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥過程？這將是我們繼續(xù)研究的目標(biāo)。這些研究完成后將可以系統(tǒng)地闡述肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的分子機(jī)制，從而使逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥成為可能，最終能使化療明顯延長術(shù)后腫瘤患者及晚期腫瘤患者的存活期。

[1] 楊濤,孫軼飛,王立偉,等.KIF14過表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌手術(shù)預(yù)后密切相關(guān)[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(3):263-265.

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(本文編輯：許卓文)

INHIBITINGKIF14EXPRESSIONINCREASESSENSITIVITYOFHEPATOCELLULARCARCINOMATOPACLITAXEL

LIXiaona1,HANXue1,YANGTao2,WANGHonglei2，GAOPengzhi2，ZHAOWei2
(1.DepartmentofGeneralSurgery,theSportsScienceInstituteofHebeiProvince,Shijiazhuang050000,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveThisstudyobservestheeffectofpaclitaxelonlivercancercellproliferationbyinhibitingKIF14expressioninlivercancercells.MethodsSilencedKIF14expressioninlivercancercellsbyRNAinterference,thesecellsweredeltbypaclitaxelandtheproliferationabilityoflivercancercellswasdeterminedbyMTTtest.ResultsSilenceKIF14expressioninlivercancercellsenhancedthecellssensitivitytopaclitaxel.ConclusionKIF14isimportantintheprocessofdrugresistanceproducedbyhumanhepatocellularcarcinomacells.Furtherstudyonitsmechanismcanprovidetheoreticalbasisforseekingtheeffectivewaystoovercomedrugresistanceoflivercancer.

liverneoplasms；kinesin；antineoplasticagents

2014-04-02；

2014-05-16

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(132777236)

李曉娜(1979-) 女，滿族，吉林吉林人，河北省體育科學(xué)研究所主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事普通外科疾病診治研究。

R735.7

A

1007-3205(2014)08-0886-03