中藥軟肝寧對實驗性肝纖維化大鼠TGFβ1、Smad2/3表達的影響

王桂杰 李 巖

·論著·

中藥軟肝寧對實驗性肝纖維化大鼠TGFβ1、Smad2/3表達的影響

王桂杰 李 巖

目的 觀察四氯化碳(CCl4)誘導大鼠肝纖維化后應(yīng)用軟肝寧的療效及作用機制。方法 用40% CCl4對Wistar大鼠造模8周, 將50只分為中藥預(yù)防組、中藥治療組、模型對照組及正常對照組,用軟肝寧于造模第1周及第4周開始灌胃。運用免疫組織化學(S-P)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)、Smad2/3在肝內(nèi)表達, 堿水解法檢測肝組織羥脯胺酸(Hyp)含量, 酶聯(lián)免疫法檢測肝組織內(nèi)透明質(zhì)酸(HA)的含量。結(jié)果 經(jīng)軟肝寧防治后大鼠肝組織內(nèi)TGFβ1、Smad2/3表達減少, 透明質(zhì)酸、羥脯胺酸水平降低。結(jié)論 復方中藥制劑軟肝寧能有效地逆轉(zhuǎn)四氯化碳誘導肝纖維化大鼠的纖維化, 其機理可能是抑制肝內(nèi)TGFβ1、Smad2/3 表達。

中藥；肝纖維化； 羥脯胺酸；透明質(zhì)酸；轉(zhuǎn)化生長因子β1；Samd2/3

本文針對肝纖維化“瘀血”、“癥積痞塊”所致病理癥結(jié),擬以疏肝理脾、活血化瘀治療原則的軟肝寧方劑, 進行實驗研究, 以期闡明該方治療肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由中國醫(yī)科大學第二臨床學院實驗動物中心提供的雌雄各半、清潔級 Wistar大鼠50只。

1.1.2 實驗藥物 軟肝寧內(nèi)含柴胡20 g、白術(shù)12 g、桃仁12 g等, 購于遼寧中醫(yī)學院藥劑科, 煎好用干燥箱加工成顆粒劑備用, 用前溶解成濃度0.4 g/ml的溶液。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 模型制備 肝纖維化大鼠模型制作參照Mont fort等方法略加改進。Wistar 大鼠, 雌雄各半, 體質(zhì)量160～260 g,按2 ml/kg體質(zhì)量, 2次/周腹腔注射40 % CCl4造模8周。

1.2.2 主要試劑 羥脯胺酸(Hyp)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(HA)試劑盒購于上海森雄科技實業(yè)有限公司；免疫組織化學TGFβ1、Smad2/3一抗及二抗試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 主要儀器 全自動圖像分析系統(tǒng)為C5050及圖像分析軟件。

1.3 方法

1.3.1 分組及用藥 大鼠50只, 隨機分為四組：A組為正常組(即空白對照組)(n=8), B組為肝纖維化模型組(n=12), C組為中藥預(yù)防組(n=12), D組為中藥治療組(n=18)。B、C、D組造膜, C、D 組分別于造模第1、4周開始中藥軟肝寧灌胃, C組、D組3 ml/kg灌胃。全部大鼠于第8 周末處死, 處死前稱體質(zhì)量, 剖腹取肝右葉于10%中性甲醛固定, 余肝組織-70℃冰箱保存。

1.3.2 實驗方法 HA均需要肝勻漿制備：肝組織解凍后,生理鹽水反復沖洗, 濾紙吸干, 切取小塊, 電子分析天平精確稱重(150±5)mg, 置于干凈試管內(nèi), 按1 1:9加入生理鹽水,高速分散器勻漿, 低溫高速離心機3000 r/min , 15 min后, 取上清液, 以上操作均于冰浴中進行, 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法按試劑盒說明進行檢測。Hyp檢測為堿水解法, 按試劑盒說明進行。免疫組化采用S -P法檢測, 按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 免疫組化結(jié)果量化 隨機選取每張切片6個視野(×400倍), 采用全自動圖像分析進行定量分析, 測定陽性細胞的吸光度(A值)及面積, 以兩者乘積表示組織中該抗原相對含量, 乘積越大表示抗原含量越高。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析, 計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(s)表示, 采用t檢驗, P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般狀況觀察 模型組大鼠從實驗開始后1 周起每次腹腔注射后興奮, 躁動不安。隨著造模時間延長, 飲食下降, 喜臥, 毛色漸無光澤, 大便稀軟不成形, 體質(zhì)量明顯比正常組低, 精神萎靡不振。應(yīng)用軟肝寧灌胃后飲食好轉(zhuǎn)、體質(zhì)量增加。實驗過程中B組大鼠死亡4只, C組實驗中死亡3只, D組實驗中死亡5只, 實驗結(jié)束時各組大鼠數(shù)量: 正常組8只, 模型組8 只, 中藥預(yù)防組9只, 中藥治療組13只。實驗終末A組平均每只體質(zhì)量增加(107.00±12.20)g；B組每只體質(zhì)量增加(45.75±10.01)g；顯著低于A 組(P＜0.01)；C組平均每只體質(zhì)量增加(65.2±9.3)g, D組平均每只體質(zhì)量增加(63.85±10.86)g, C、D組與A組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 TGFβ1、Smad2/3在肝組織中的表達與分布 陽性組織呈棕色, 陰性部分呈藍色。①A組肝組織: Smad2/3在正常肝細胞內(nèi), 匯管區(qū)基質(zhì)及間質(zhì)細胞胞漿內(nèi)均無表達, TGFβ1在上述部位無表達, 在Disse 間隙偶有表達。②B組肝組織: 肝內(nèi)TGFβ1、Smad2/3表達明顯強, TGFβ1表達極為強烈, 陽性細胞數(shù)目明顯增多, 主要見于小葉周圍擴大的纖維組織內(nèi)的成纖維細胞、竇周細胞、炎性細胞以及增生的膽小管周圍梭狀細胞及肝細胞內(nèi), 陽性物質(zhì)主要集中在胞漿內(nèi), 胞膜上也有少量表達。本組肝組織Smad2/3 表達主要集中在肝細胞胞漿內(nèi), 陽性細胞著色棕黃。③ C、D組：TGFβ1、Smad2/3在肝組織內(nèi)的表達量較B組減少, 陽性表達集中同B組, 陽性程度弱于B 組, D組表達明顯強于C組。各種成分在不同實驗組中表達經(jīng)計算機軟件分析結(jié)果,見表1, 圖1。

表1 中藥對大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度表達量化結(jié)果的影響(s)

表1 中藥對大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3平均光密度表達量化結(jié)果的影響(s)

注：與正常組比較aP＜0.01；與模型組比較bP＜0.01；與治療組比較cP＜0.05；與治療組比較dP＞0.05

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圖1 中藥對各組大鼠肝組織中TGFβ1和Smad2/3光密度量化結(jié)果的影響

2.3 中藥軟肝寧對CCl4肝纖維化大鼠肝組織的Hyp、HA影響 試驗結(jié)束時模型組肝組織Hyp、HA數(shù)值遠遠高于正常組, 而中藥治療組和中藥預(yù)防組Hyp、HA數(shù)值低于模型組。各組與正常組比較, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01), 預(yù)防組、治療組與模型組比較, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01), 預(yù)防組觀察指標雖明顯優(yōu)于治療組, 但兩者比較差異無統(tǒng)計學意義。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝組織Hyp及HA比較(s)

表2 各組大鼠肝組織Hyp及HA比較(s)

注：與正常組比較bP＜0.01, 與模型組比較aP＜0.01, 與治療組比較cP＞0.05

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3 討論

軟肝寧方劑中柴胡為君藥疏肝, 臣藥炒白術(shù)補脾, 再配以丹參、川芎、桃仁等活血化瘀, 符合中醫(yī)辨證治療纖維化原則。方中丹參能夠顯著抑制成纖維細胞的增生, 使星狀細胞凋亡［1］。川芎嗪能減少透明質(zhì)酸和膠原產(chǎn)生, 并提高肝組織SOD的活性, 減少TGFβ1和Smad 2/3的分泌, 從而抑制肝星狀細胞活化, 減緩肝纖維增生的程度［2］。桃仁主要含扁桃甙, 抗肝纖維化機制是能增加肝血流量, 降低肝組織膠原含量, 促進肝內(nèi)纖維膠原分解代謝［3］。

TGFβ1是目前已知的加快肝纖維化的最重要細胞因子之一［4］。在肝臟中肝星狀細胞、肝細胞、枯否氏細胞、血小板等多種細胞產(chǎn)生此種因子, 可促進HSC活化并分泌多種膠原,激活靜止狀態(tài)的HSC, 抑制細胞外基質(zhì)( ECM)降解、進而抑制肝細胞再生［5］。Smads 蛋白TGFβ1超家族的信號在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的蛋白, 是TGFβ/Smad信號通路中組成部分, 在調(diào)控TGFβ1介導的細胞外基質(zhì)積聚過程中起作用, 能介導TGFβ1信號轉(zhuǎn)導, 促進肝纖維化形成。Smad2和Smad3是Ⅰ型受體激酶的底物, 兩者介導類似的信號且氨基酸序列高度同源。TGFβ1同時使Smad2和Smad3磷酸化, 是TGFβ/Smad信號轉(zhuǎn)運通路中的橋梁, 抑制它們的生成、核轉(zhuǎn)位和磷酸化, 進而抑制肝纖維化, 其中Smad3與肝纖維化的關(guān)系最為密切［6,7］。

肝星狀細胞能產(chǎn)生HA, 其內(nèi)皮細胞中降解, 肝纖維化時產(chǎn)生增加。肝纖維化時肝星狀細胞合成HA增加, 攝取降解減少, 是判定肝纖維化活動較敏感的指標［8,9］。肝細胞受損后釋放出羥脯胺酸, 它是肝臟膠原蛋白獨有的氨基酸, 測定其含量, 可確定膠原總體含量, 可推算膠原增生與肝纖維化程度［10］。

本實驗隨著CCl4給藥時間的增長, 大鼠肝組織透明質(zhì)酸和羥脯胺酸結(jié)果顯示, 模型組大鼠HA、Hyp數(shù)值升高, 中藥預(yù)防組和治療組, HA、Hyp數(shù)值也有所升高, 這三組與正常組相比P＜0.01, 差異有統(tǒng)計學意義。本實驗說明隨著肝纖維化表現(xiàn)的加重, 肝組織內(nèi)反映肝纖維化指標HA、Hyp的數(shù)值也相應(yīng)升高, 而應(yīng)用中藥可降低肝細胞中Hyp、HA。

Wistar大鼠肝組織中TGFβ1、Smad2/3免疫組化染色顯示：模型組顯微鏡下陽性細胞數(shù)量及分布范圍明多于中藥治療組和預(yù)防組, 計算機光密度分析數(shù)據(jù)與鏡下觀測結(jié)論一致,模型組與預(yù)防組和治療組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。這說明中藥軟肝寧是通過減少活化的星狀細胞分泌TGFβ1、減輕細胞的壞死和變性, 恢復肝功能, 抑制膠原沉積和生成,抑制肝細胞內(nèi)Smad2和Smad3蛋白質(zhì)的表達和磷酸化, 減少TGFβ1表達, 抑制星狀合成膠和原［11］。由此研究可進一步得出結(jié)論：肝組織中Smad2/3蛋白質(zhì)增多, TGFβ1分泌增加導致肝星狀細胞增殖, 它們之間正相關(guān), 與相關(guān)文獻報道相似［7］。

本研究表明復方中藥方軟肝寧能延緩肝纖維化, 其機制可能是抑制TGFβ1表達其下游信號Smad2/3, 減少肝內(nèi)膠原生成和沉淀, 減輕免疫損害, 降低肝臟的纖維化, 可臨床推廣價值此類復方中藥。

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Effect of traditional Chinese medicine Ruan Gan Ning on the expression of TGFβ1and Smad2/3 in the experimental rat hepatic fibrosis

WANG Gui-jie.LI Yan.Shengyang Sixth People's Hopspital, Shenyang 110006, China

Objective To observe the therapeutic effect and mechanism of Ruan Gan Ning on the rat hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride(CCL4).Methods 50 Wistar rats were divided into normal control , model control, TCM prevention and TCM therapy groups.At the first and forth week of model-making, the rats were given Ruan Gan Ning through intragastric administration.The expression of TGFβ1and Smad2/3 in the liver tissue was detected with immunohistochemistry(S-P) and the content of Hyp with alkaline hydrolysis, the content of hyaluronic acid(HA) with euzymelinked immunosorbent assay.Results After the application of Ruan Gan Ning the expression of TGFβ1, Smad2/3 and the level of HA and Hypdecreased in the experimental rat hepatic fibrosis.Conclusion Ruan Gan Ning can relieve the rat hepatic fibrosis induced by CCL4 a nd the mechanism of action may be its inhibition of expression of TGFβ1, Smad2/3 in the liver tissue.

Traditional Chinese medicine; Hepatic fibrosis; Hyaluronic acid; Transforming growth factor β1; Smad2/3

2014-03-20］

110006 遼寧省沈陽市第六人民醫(yī)院消化門診(王桂杰)；中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院消化內(nèi)科(李巖)

王桂杰