ADAM9特異性siRNA對(duì)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞ADAM9基因表達(dá)及體外侵襲能力的影響

張新恒，馬曜輝，單中杰

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處 新鄉(xiāng) 473003 2)鄭州人民醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450003

ADAM9特異性siRNA對(duì)腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞ADAM9基因表達(dá)及體外侵襲能力的影響

張新恒1)，馬曜輝1)，單中杰2)#

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處 新鄉(xiāng) 473003 2)鄭州人民醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450003

#通訊作者，男，1964年12月生，博士，教授，研究方向：尿路疾病，E-mail：shanzhongjie@vip.sina.com

腎透明細(xì)胞癌；去整合素金屬蛋白酶9；侵襲

目的：探討去整合素金屬蛋白酶9(ADAM9)特異性siRNA對(duì)人腎透明細(xì)胞癌(RCCC)786-0細(xì)胞中ADAM9基因表達(dá)及體外侵襲能力的影響。方法設(shè)計(jì)合成ADAM9特異性siRNA。將786-0細(xì)胞分4組處理，分別為正常對(duì)照組(正常培養(yǎng)786-0細(xì)胞)、空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染無(wú)義 siRNA)和ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞ADAM9 mRNA的表達(dá)；轉(zhuǎn)染48 h后，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞ADAM9蛋白的表達(dá)， 并用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組786-0細(xì)胞ADAM9 mRNA的表達(dá)顯著低于其他3組(F=47.945、180.456、60.978，P均<0.001)；轉(zhuǎn)染48 h后，ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組786-0細(xì)胞ADAM9蛋白表達(dá)顯著降低(F=142.816，P<0.001)，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(F=45.389，P<0.001)。結(jié)論ADAM9特異性siRNA能夠有效沉默786-0細(xì)胞中ADAM9的表達(dá)并降低其體外侵襲能力。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是在mRNA水平上沉默基因表達(dá)的過(guò)程，目前RNAi已成為研究基因功能的一種重要的實(shí)驗(yàn)方法[1]。腎透明細(xì)胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)是最常見(jiàn)的成年人腎臟惡性腫瘤，由于癌細(xì)胞可表達(dá)多種耐藥蛋白,因此對(duì)常規(guī)化療不敏感，對(duì)放療也不敏感。對(duì)于晚期腎癌或轉(zhuǎn)移癌，近年的分子靶向治療雖取得了一定的成績(jī)，但總體上存在著完全緩解率低、有一定副作用、個(gè)體差異顯著等問(wèn)題[2]。去整合素金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9，ADAM9)是去整合素金屬蛋白酶家族成員之一，在RCCC組織中高表達(dá)并與患者的腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)[3]，但其促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的具體機(jī)制尚不明確。作者采用RNAi、RT-PCR、Western blot、Transwell等方法探討了ADAM9特異性siRNA對(duì)人RCCC 786-0細(xì)胞中ADAM9基因的表達(dá)及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料786-0細(xì)胞及專用培養(yǎng)基購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。ADAM9特異性siRNA ADAM9-siRNA-2366：正義鏈5’-CCAGAGA AGUUCCUAUAUA-3’，反義鏈5’-UAUAUAGGAAC UUCUCUGG-3’； 無(wú)義siRNA(NC siRNA)：正義鏈5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ ，反義鏈5’-AAA CGUGACACACGUUCGGAGAA-3’。上述siRNA均由美國(guó)百奇公司設(shè)計(jì)合成。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及低血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。ADAM9引物(上游 5’-CATTGAGGGAGGGACTTCT GGT-3’，下游5’-ATGGGAACTGCTGAGGTTGCTT-3’，產(chǎn)物大小282 bp)由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。β-actin引物(上游5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAG G-3’，產(chǎn)物大小205 bp)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。兔抗人ADAM9抗體購(gòu)自美國(guó)百奇公司。抗β-actin兔多克隆抗體、RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq MasterMix、哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒BeyoECL Plus購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所?？讖? μm Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自康寧公司。基質(zhì)膠購(gòu)自BD Biosciences公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為4組。正常對(duì)照組：正常培養(yǎng)786-0細(xì)胞，不做處理?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染組：以體積分?jǐn)?shù)0.2%的LipofectamineTM2000處理786-0細(xì)胞。陰性轉(zhuǎn)染組：用體積分?jǐn)?shù)0.2%的LipofectamineTM2000及80 nmol/L的NC siRNA處理細(xì)胞。ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組：用體積分?jǐn)?shù)0.2%的LipofectamineTM2000及80 nmol/L的ADAM9-siRNA-2366處理細(xì)胞。

1.3細(xì)胞中ADAM9mRNA的檢測(cè)轉(zhuǎn)染24、48、72 h后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR。PCR條件：94 ℃預(yù)變性 2 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸2 min，4 ℃保存。以β-actin為內(nèi)參。產(chǎn)物經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，EB染膠，用凝膠成像儀拍照，用ImageJ軟件對(duì)圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以ADAM9與β-actin條帶灰度值的比值表示ADAM9 mRNA的表達(dá)水平[4]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞中ADAM9蛋白的檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，吸掉培養(yǎng)基，按哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總蛋白，按蛋白定量試劑盒Bradford比色法繪制蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。按SDS-PAGE凝膠制備試劑盒操作步驟配制SDS-PAGE凝膠。每孔上樣60 μg，濃縮膠80 V、分離膠120 V電泳約30 min。切膠,轉(zhuǎn)膜1～2 h,TBST洗膜，50 g/L脫脂奶粉封閉，一抗(ADAM9兔多克隆抗體稀釋100倍，內(nèi)參β-actin抗體稀釋1 000倍)孵育過(guò)夜。TBST洗膜15 min×3次，HRP(抗兔)10 mL孵育4 h，漂洗3～5次，每次3 min。將超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中A液、B液各0.5 mL混勻，暗環(huán)境下加到PVDF膜上，凝膠成像儀拍照，用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以ADAM9與β-actin條帶灰度值的比值表示ADAM9蛋白的表達(dá)水平[4]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度均等。冰上融化基質(zhì)膠，包被Transwell內(nèi)室的基底膜。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。下室內(nèi)為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，上室內(nèi)為200 μL含低血清培養(yǎng)基的濃度相同的細(xì)胞懸液。孵育12 h后取出,擦去內(nèi)表面的基質(zhì)膠及未穿膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定，蘇木素伊紅染色,鏡下觀察拍照, 每孔取3個(gè)視野(100倍)分別計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值，用穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞的侵襲能力[4]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理，4組間ADAM9 mRNA、蛋白表達(dá)水平及穿膜細(xì)胞數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞ADAM9mRNA的表達(dá)見(jiàn)圖1及表1。ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，細(xì)胞中ADAM9 mRNA表達(dá)均明顯降低，以轉(zhuǎn)染48 h的沉默效果最好。

圖1 4組細(xì)胞ADAM9 mRNA的表達(dá)

1:DNA Marker；2:正常對(duì)照組；3:空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組；4:陰性轉(zhuǎn)染組；5、6:ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組。

表1 4組細(xì)胞ADAM9 mRNA的表達(dá)

*：與其他3組比較，P<0.01。

2.2 4組細(xì)胞ADAM9蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖2和表2。

圖2 4組細(xì)胞ADAM9蛋白的表達(dá)

M:Marker；1:正常對(duì)照組；2：空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組；3：陰性轉(zhuǎn)染組；4：ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組。

2.3 4組細(xì)胞侵襲能力的比較見(jiàn)表2。ADAM9 siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)較其他3組明顯減少。

表2 4組細(xì)胞ADAM9蛋白表達(dá)及穿膜細(xì)胞數(shù)的比較

*：與其他3組比較，P<0.01。

3 討論

RCCC是成年人腎臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且近年來(lái)發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。已經(jīng)批準(zhǔn)上市的分子靶向治療藥物有索拉非尼、舒尼替尼等，還有些腎癌靶向治療藥物正在研究中。靶向治療為不能手術(shù)切除的腎癌或晚期轉(zhuǎn)移腎癌的治療帶來(lái)了新的希望, 但這些治療普遍存在完全緩解率低、有一定的副作用等問(wèn)題[5]。研究和發(fā)現(xiàn)新的更有效的RCCC診療作用靶點(diǎn)具有重要的意義。

ADAM9是去整合素金屬蛋白酶家族成員之一，研究證實(shí)ADAM9在多種腫瘤如乳癌[6]、結(jié)腸癌[7]、胰腺癌[8]等中高表達(dá)，并與腫瘤的進(jìn)展侵襲等表型相關(guān)。體外研究[9]證實(shí)ADAM9基因沉默可抑制乳癌細(xì)胞的體外侵襲能力。抑制ADAM9的表達(dá)可誘導(dǎo)前列腺癌上皮細(xì)胞表型的改變，并增加人類前列腺癌細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性[10]。ADAM9在非小細(xì)胞肺癌中的過(guò)度表達(dá)與腦轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)[11]。去勢(shì)治療后的前列腺癌組織中ADAM9表達(dá)降低，并可作為一個(gè)良好的預(yù)后指標(biāo)[12]。研究[3]還表明，ADAM9在腎細(xì)胞癌中高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)陽(yáng)性狀態(tài)及腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。

該研究中作者采用RNAi技術(shù)體外沉默人RC-CC 786-0細(xì)胞ADAM9的表達(dá)，結(jié)果顯示ADAM9特異性siRNA能夠在mRNA水平和蛋白水平有效沉默786-0細(xì)胞中ADAM9基因的表達(dá)；同時(shí)Transwell侵襲性小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ADAM9特異性siRNA轉(zhuǎn)染后的786-0細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。上述結(jié)果提示，ADAM9與786-0細(xì)胞的體外侵襲能力有關(guān)，ADAM9特異性siRNA能夠有效地沉默786-0細(xì)胞ADAM9的表達(dá)，并降低786-0細(xì)胞的體外侵襲能力。這為RCCC的靶向治療提供了新的研究思路。

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(2013-04-11 收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

Effect of ADAM9 targeted siRNA on ADAM9 gene expression and invasion capacity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells in vitro

ZHANGXinheng1),MAYaohui1),SHANZhongjie2)

1)OfficeforGraduateStudents,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang473003 2)DepartmentofUrology,thePeople’sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450003

renal clear cell carcinoma；a disintegrin and metalloprotease 9；invasion

Aim: To explore the effect of a disintegrin and metalloprotease 9(ADAM9) targeted siRNA on ADAM9 gene expression and invasion capacity of renal clear cell carcinoma 786-0 cells. Methods:ADAM9 specific siRNA was designed and synthesized.786-0 cells were divided into 4 group:normal cultured group, LipofectamineTM2000 transfection group, unrelated sequence siRNA (NC siRNA)transfection group and ADAM9 specific siRNA transfection group. RT-PCR was applied to detect ADAM9 mRNA in 786-0 cells after transfection for 24,48,and 72 h.ADAM9 protein was detected by Western blot after transfection for 48 h， and cell invasion was detected with Transwell. Results: The expression of ADAM9 mRNA in ADAM9 specific siRNA transfection group after transfection for 24,48,and 72 h were lower(F=47.945，180.456,60.978，P<0.001),and ADAM9 protein expression and invasion capacity were significantly lower after transfection for 48 h(F=142.816,45.389，P<0.001).Conclusion: ADAM9 specific siRNA can silence ADAM9 gene in 786-0 cells and inhibit its invasion.

R737.11

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.016