阿爾茨海默病患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶2和9水平的測(cè)定

郭曉紅，盧 宏，牛瑞娜，方 立，逯 瑞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

阿爾茨海默病患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶2和9水平的測(cè)定

郭曉紅，盧 宏#，牛瑞娜，方 立，逯 瑞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

#通訊作者，女，1965年4月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病及神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，E-mail：luhong81@yeah.net

阿爾茨海默?。换|(zhì)金屬蛋白酶2；基質(zhì)金屬蛋白酶9

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年期常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是癡呆的主要類型。國(guó)外最新的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)的推薦指南中已納入了如腦脊液中β-淀粉樣蛋白(Aβ)、Tau蛋白等生物標(biāo)志物[1]，說明生物標(biāo)志物在AD診斷中的作用日益受到重視，然而具有較高敏感度及特異度的血漿診斷標(biāo)志物目前尚未找到[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組鋅/鈣依賴的蛋白酶家族，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)重組和修復(fù)。其中MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系密切，成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的熱點(diǎn)。近年有證據(jù)[3]表明，MMPs可能參與AD形成，且MMP-3與AD的嚴(yán)重程度相關(guān)。但國(guó)內(nèi)尚無有關(guān)血MMP-2、MMP-9水平與AD嚴(yán)重程度相關(guān)性的研究。該實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定AD患者與正常對(duì)照人群血清MMP-2、MMP-9的水平，探討血清MMP-2、MMP-9與AD嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象對(duì)照組：為鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年10月健康體檢人員30例，男15例，女15例，年齡55～80(68.2±6.1)歲，均根據(jù)病史、神經(jīng)和精神檢查、腦電圖、顱腦磁共振或CT檢查排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及癡呆。AD組：收集2011年8月至2012年12月90例AD患者，分別來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院及鄭州市郊的養(yǎng)老院，男45例，女45例，年齡55～80(65.4±8.5)歲，受教育時(shí)間均>5 a，且均無心、肝、腎等重大疾病。AD組再分為輕度組、中度組和重度組，每組各30例，男15例，女15例；年齡輕度組55～80(64.8±8.5)歲，中度組55～80(65.1±7.8)歲，重度組55～80(65.8±8.9)歲。

1.2AD患者入選及分度標(biāo)準(zhǔn)AD患者入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病及語言交流障礙和卒中研究所、AD及相關(guān)疾病協(xié)會(huì)推薦的臨床AD診斷標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)精神疾病分類方案與診斷標(biāo)準(zhǔn)第2版，結(jié)合簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(MMSE)韋氏量表檢測(cè)評(píng)分，確認(rèn)其記憶、智能障礙程度。頭部CT或MRI掃描排除器質(zhì)性病變所致的癡呆。排除各種原因?qū)е虏荒芘浜狭勘頇z查的患者。進(jìn)行成套神經(jīng)心理量表檢查，以排除假性癡呆(如抑郁性癡呆)、精神發(fā)育遲滯、歸因于社會(huì)環(huán)境極度貧乏和教育受限的認(rèn)知功能低下或藥源性智能損害的患者。并進(jìn)行相關(guān)血清學(xué)檢查，排除肝功能衰竭、惡性貧血、甲狀腺功能減低或亢進(jìn)、神經(jīng)梅毒、朊蛋白病及艾滋病等引起的癡呆綜合征。將AD患者根據(jù)MMSE評(píng)分分為輕度、中度、重度組：21～26分的患者納入輕度組，10～20分的患者納入中度組，<10分的患者納入重度組。以上患者的分組均經(jīng)2名以上神經(jīng)科醫(yī)師通過病史及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。所有受試者均簽署知情同意書。

1.3血清MMP-2和MMP-9的檢測(cè)受試者均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采取肘靜脈血2 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝試管內(nèi)，搖勻，離心取上清液置入EP管中，-80 ℃保存。采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。往預(yù)先包被MMP-2/9抗體的包被微孔中依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，溫育60 min并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-2/9呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A值)，計(jì)算樣品濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。4組受試者血清MMP-2和MMP-9水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，AD組患者血清MMP-2水平與MMP-9水平的相關(guān)性分析采用Pearson積差相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組血清MMP-2和MMP-9水平結(jié)果見表1。4組間MMP-2和MMP-9比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 4組血清MMP-2和MMP-9水平的比較 μg/L

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與輕度組比較，P<0.05；▲：與中度組比較，P<0.05。

2.2AD組患者血清MMP-2水平與MMP-9水平的相關(guān)性分析AD組患者血清MMP-2水平與MMP-9水平呈正相關(guān)(r=0.833,P=0.005)。

3 討論

AD的病因至今仍不十分明確，而Aβ是各種原因誘發(fā)AD的共同通路。在AD患者體內(nèi)，由于β分泌酶含量及活性增高，Aβ的產(chǎn)量隨之也異常增加[4]。Aβ在腦內(nèi)堆積可造成記憶損害、膽堿能及多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能減退和形態(tài)學(xué)的退行性變化[5]。MMPs是目前在腦脊液中發(fā)現(xiàn)的與Aβ代謝密切相關(guān)的重要金屬酶之一[3]。MMPs是蛋白酶超家族，可由正常組織細(xì)胞、炎癥細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌，其主要功能為降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，對(duì)基質(zhì)重構(gòu)有重要意義，參與多種生理及病理過程。Aβ注射法所建立的AD模型大鼠海馬組織中MMP-2蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組增高[6]。免疫組化顯示在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)增加，實(shí)時(shí)PCR顯示MMP-2 mRNA表達(dá)水平也升高[7]。對(duì)鼠的研究[8]發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠介導(dǎo)MMP-9增量調(diào)節(jié)。尸檢[9]結(jié)果顯示，AD 患者腦組織中多種MMPs表達(dá)增加，且Aβ可以促進(jìn)MMP-9的產(chǎn)生，而后者有水解Aβ的作用。AD患者死后尸解[10]證明其腦組織中MMP-2、MMP-9過度表達(dá)，通常以酶原形式存在于細(xì)胞外淀粉樣斑塊中，被彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、超氧負(fù)離子等水解而轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?，水解Aβ 34Leu-35Met之間的化學(xué)鍵，減少Aβ在大腦中的堆積。

該研究發(fā)現(xiàn)，AD組患者的MMP-2、MMP-9水平均高于對(duì)照組，且疾病嚴(yán)重程度不同患者間的MMP-2、MMP-9水平也有差異，重度AD患者的MMP-2、MMP-9水平高于中度AD患者，且中度AD患者高于輕度AD患者。因此，推測(cè)Aβ在AD患者大腦組織中大量表達(dá)，刺激MMP-2、MMP-9合成，MMP-2、MMP-9反過來又水解Aβ，同時(shí)也降解細(xì)胞外基質(zhì)和髓鞘堿性蛋白，導(dǎo)致血腦屏障的破壞及功能的缺失，加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元凋亡，引起白質(zhì)損傷。所以MMP-2、MMP-9與AD的病情進(jìn)展、嚴(yán)重程度可能相關(guān)，且AD患者外周血MMP-2、MMP-9水平增高可能與腦組織MMP-2、MMP-9水平增高有關(guān)。

綜上所述，MMPs在AD的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，血清MMP-2、MMP-9水平與AD的嚴(yán)重程度可能相關(guān)。檢測(cè)血清MMP-2、MMP-9水平無創(chuàng)傷性，且具有簡(jiǎn)便實(shí)用的特點(diǎn)，便于在臨床工作中開展，為AD的診治提供了幫助。但由于該次試驗(yàn)樣本例數(shù)有限，研究結(jié)果及推論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(2013-04-01 收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.040