富血小板纖維蛋白對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞遷移及成骨分化的影響

李 瑋，李坤陽(yáng)，范 云，余方方，陳 棟#

1)鄭州人民醫(yī)院頤和醫(yī)院口腔科 鄭州 450008 2)鄭州市口腔醫(yī)院牙周科 鄭州 450000 3)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

富血小板纖維蛋白對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞遷移及成骨分化的影響

李 瑋1)，李坤陽(yáng)2)，范 云3)，余方方3)，陳 棟3)#

1)鄭州人民醫(yī)院頤和醫(yī)院口腔科 鄭州 450008 2)鄭州市口腔醫(yī)院牙周科 鄭州 450000 3)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052

#通訊作者，男，1971年10月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：牙周病病因防治，E-mail：chendongfmmu@163.com

牙周膜成纖維細(xì)胞；富血小板纖維蛋白；遷移；成骨分化

目的：觀察Choukroun’s富血小板纖維蛋白(PRF)對(duì)自體人牙周膜成纖維細(xì)胞(hPDLCs)遷移、成骨分化的影響，探討PRF在牙周組織再生治療中的潛能。方法原代培養(yǎng)hPDLCs；制備PRF，實(shí)驗(yàn)分為P1組(1片PRF浸出液)、P2組(2片PRF浸出液)和對(duì)照組，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察記錄各組第24、48、72 h細(xì)胞遷移的距離；Transwell制備遷移模型，按實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)24 h后結(jié)晶紫染色觀察；成骨礦化誘導(dǎo)液制備不同濃度的PRF浸出液(P1組、P2組)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測(cè)3、5、7 d細(xì)胞破碎液中ALP活性；成骨礦化誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)21 d，茜素紅染色后測(cè)定礦化結(jié)節(jié)面積。結(jié)果劃痕實(shí)驗(yàn)中P1組、P2組細(xì)胞遷移距離大于對(duì)照組(F=316.248、32.846和1 169.847，P均<0.001)，P1組、P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)中P1組、P2組與對(duì)照組比較，遷移細(xì)胞數(shù)增加(F=742.729，P<0.001)，P1組、P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ALP活性P1組、P2組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=474.202、1 383.521、2 317.965，P均<0.001)，P1組、P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。P1組、P2組與對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=332.280，P<0.001)，P1組與P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)RF對(duì)hPDLCs具有促進(jìn)其遷移和成骨分化的作用，提示PRF在牙周組織再生工程中具有很大的臨床應(yīng)用潛能。

Choukroun’s富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)是通過(guò)自體外周血一次離心獲取的富含白細(xì)胞和血小板的纖維蛋白凝膠。血小板在組織抗感染和愈合過(guò)程中起著重要的作用，其釋放的各種生長(zhǎng)因子可影響細(xì)胞的附著、增殖等一系列生物學(xué)行為，被用于各種組織修復(fù)的臨床治療[1]。許多研究[2]都是為了尋找更好的促進(jìn)牙周組織再生的方法，包括生長(zhǎng)因子的應(yīng)用、EMD處理根面等，但這些治療的臨床效果尚不能完全確定，且增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此需要尋找一種經(jīng)濟(jì)有效的生物活性材料用于牙周組織再生治療。目前少有PRF對(duì)牙周膜細(xì)胞遷移及成骨分化影響的實(shí)驗(yàn)研究，該實(shí)驗(yàn)將PRF浸出液與人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)共培養(yǎng)，體外觀察PRF對(duì)hPDLCs生物學(xué)行為的作用，為PRF應(yīng)用于牙周組織再生工程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))，RPMI 1640培養(yǎng)基(Solarbio公司，北京)，CCK-8(同仁公司，日本)，Transwell 小室(Corning公司，美國(guó))，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(建成公司，南京)，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(賽業(yè)公司，廣州)。

1.2hPDLCs原代培養(yǎng)及鑒定經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)，向每位被采集牙周膜組織的患者充分說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)、目的、可能的收益和風(fēng)險(xiǎn)以及《赫爾辛基宣言》規(guī)定的原則和義務(wù)，在沒(méi)有強(qiáng)迫、不正當(dāng)壓力和引誘的情況下，與每位受試患者簽署《富血小板纖維蛋白研究知情同意書(shū)》。取材于河南省口腔醫(yī)院收治的12～18歲因正畸拔除的牙周健康、無(wú)齲壞的新鮮前磨牙。酶消組織塊法原代培養(yǎng)hPDLCs，免疫熒光法DAPI染色鑒定。

1.3PRF及其浸出液的制備采用Choukroun方法制備PRF[1]，無(wú)菌采血管采取牙周膜組織來(lái)源同一患者肘靜脈血，3 000 r/min離心10 min，靜置10 min，剪去紅細(xì)胞層，無(wú)菌紗布輕壓10 s制成膜片。

取5 mL血液制備1片PRF膜片，將1片和2片PRF分別放入無(wú)菌EP管中，加入5 mL含體積分?jǐn)?shù)2%或不含 FBS的RPMI 1640及成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液，CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h。吸出浸出液于EP管中，4 ℃保存[3]。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)觀察PRF對(duì)hPDLCs遷移的影響6孔板背后劃平均寬度的5條平行橫線，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105mL-1后接種于6孔板。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用10 μL的槍頭劃1條垂直于橫線的劃痕，劃破單層細(xì)胞。分別加入1片PRF(P1組)、2片PRF(P2組)的浸出液，對(duì)照組加入不含PRF的RPMI 1640培養(yǎng)液。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h。40倍顯微鏡下拍照記錄遷移距離。

1.5Transwell檢測(cè)PRF對(duì)hPDLCs遷移的影響

取24孔板，按1.4分組分別加入600 μL培養(yǎng)液。將Transwell小室放入24孔板內(nèi)，并加入1×105mL-1100 μL的無(wú)血清細(xì)胞懸液，孵育24 h。固定，結(jié)晶紫染色，棉簽擦去小室內(nèi)面未遷移的細(xì)胞。200倍顯微鏡下觀察，每孔選取10個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.6PRF對(duì)hPDLCs堿性磷酸酶活性的影響采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液配制PRF浸出液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL-1后接種于24孔板，按1.4分組加入培養(yǎng)液，收集3、5、7 d的細(xì)胞制備細(xì)胞破碎液。按照堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行加樣，測(cè)定吸光度值，即為堿性磷酸酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。

1.7PRF誘導(dǎo)hPDLCs成骨分化的觀察調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104mL-1后接種于6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，按1.4分組換液，連續(xù)培養(yǎng)21 d。固定，茜素紅染色，200倍顯微鏡下觀察、拍照。從各組染色結(jié)果選取10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，采用Image Pro Plus 6.0對(duì)礦化結(jié)節(jié)面積進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果取平均值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)照組、P1組和P2組細(xì)胞遷移距離、細(xì)胞遷移數(shù)、堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)面積的比較以及不同時(shí)間細(xì)胞遷移距離、堿性磷酸酶活性的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1hPDLCs的原代培養(yǎng)及鑒定所培養(yǎng)的hPDLCs呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，抗波形絲蛋白免疫熒光染色呈陽(yáng)性，抗角蛋白免疫熒光染色呈陰性，所培養(yǎng)hPDLCs為間充質(zhì)來(lái)源(圖1)。

圖1 hPDLCs免疫熒光鑒定結(jié)果(DAPI，×200)

2.2PRF及其浸出液的制備離心后管內(nèi)容物分為3層：淡黃色上清為貧血小板血漿(platelet-poorplasma，PPP)，紅色液體為紅細(xì)胞，中間層淺黃色凝膠為PRF；剪去底部的紅細(xì)胞層，無(wú)菌紗布?jí)褐菩纬砂咨て?圖2)。

圖2 PRF制備形成的3層結(jié)構(gòu)

A：離心后的3層結(jié)構(gòu)，即PPP、PRF、紅細(xì)胞層；B：PRF凝膠；C：PRF膜片。

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)觀察PRF對(duì)hPDLCs遷移的影響結(jié)果見(jiàn)圖3、表1。P1組和P2組細(xì)胞遷移的距離隨時(shí)間增加逐漸增加，且P1組和P2組細(xì)胞遷移的距離大于對(duì)照組，但P1組和P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移的情況(×40)

2.4Transwell檢測(cè)PRF對(duì)hPDLCs遷移的影響

結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。P1組、P2組細(xì)胞遷移數(shù)大于對(duì)照組，P1組、P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組細(xì)胞遷移距離比較(n=3) mm

*：與對(duì)照組比較，P<0.001; #：與24 h比較，P<0.001。

表2 各組細(xì)胞遷移數(shù)和礦化結(jié)節(jié)面積的比較(n=10)

*：與對(duì)照組比較，P<0.001。

圖4 各組細(xì)胞遷移情況和礦化結(jié)節(jié)的形成(×200)

2.5PRF對(duì)hPDLCs堿性磷酸酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)表3。各組堿性磷酸酶活性隨時(shí)間的增加持續(xù)增加，且P1組、P2組活性均高于對(duì)照組，但P1組、P2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組hPDLCs堿性磷酸酶活性比較(n=10)

*：與對(duì)照組比較，P<0.001；#：與3 d比較，P<0.001。

2.6PRF誘導(dǎo)hPDLCs成骨分化的觀察結(jié)果見(jiàn)圖4、表2。hPDLCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后表現(xiàn)成骨潛能，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)P1組、P2組礦化結(jié)節(jié)面積較對(duì)照組增加。

3 討論

牙周基礎(chǔ)治療和非手術(shù)治療主要是控制炎癥，治療后往往形成的是長(zhǎng)結(jié)合上皮性愈合，牙周組織再生治療則是使牙周炎造成的已破壞的牙周組織重建，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能。其關(guān)鍵在于具有多向分化功能的牙周膜細(xì)胞在時(shí)間和空間上優(yōu)先占領(lǐng)牙根面，形成新的牙骨質(zhì)、膠原纖維和牙槽骨，獲得真正的新附著[4]。

Choukroun’s PRF能夠釋放大量生長(zhǎng)因子：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板源性生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，這些生長(zhǎng)因子在PRF制備完成60 min內(nèi)逐漸增加，在120～300 min內(nèi)迅速釋放[5]，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移，誘導(dǎo)基質(zhì)礦化和骨基質(zhì)蛋白的分泌，誘導(dǎo)新生血管的形成，為組織修復(fù)提供氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。Tsai等[6]研究發(fā)現(xiàn)PRF可促進(jìn)hPDLCs及成骨細(xì)胞增殖而抑制牙齦上皮細(xì)胞增殖，這種細(xì)胞選擇性可以避免長(zhǎng)結(jié)合上皮的形成。該研究結(jié)果顯示2種濃度的PRF浸出液對(duì)自體hPDLCs的遷移具有明顯的促進(jìn)作用，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組hPDLCs遷移的距離和數(shù)量均高于對(duì)照組，提示PRF能夠促進(jìn)hPDLCs遷移，有利于hPDLCs在牙周組織愈合過(guò)程中優(yōu)先占領(lǐng)根面，形成新附著。

PDLCs成骨細(xì)胞表型可以在牙周組織修復(fù)中不斷形成新的牙骨質(zhì)及牙槽骨，對(duì)于牙周組織再生有著重要的作用[1]。堿性磷酸酶是參與骨組織形成、代謝和再生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，可反映細(xì)胞向成骨分化的趨勢(shì)[7]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PRF能夠增加hPDLCs的堿性磷酸酶活性，提示PRF通過(guò)促進(jìn)hPDLCs分泌與成骨相關(guān)的堿性磷酸酶、促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成，來(lái)提高h(yuǎn)PDLCs成骨分化和骨形成的能力。

hPDLCs優(yōu)先占領(lǐng)根面、快速增殖、向成骨分化形成牙骨質(zhì)和牙槽骨是新附著形成的關(guān)鍵，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PRF通過(guò)影響這一愈合過(guò)程達(dá)到促進(jìn)牙周組織再生的治療目的。PRF取自自體，不添加任何人工制劑，可以避免免疫排斥和交叉感染的發(fā)生，使用安全簡(jiǎn)便，能夠作為一種天然的、經(jīng)濟(jì)有效的、促進(jìn)組織修復(fù)的自體生物活性材料應(yīng)用于牙周組織再生。以往研究[8-9]表明PRF對(duì)成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，并表現(xiàn)有劑量依賴(lài)性。該實(shí)驗(yàn)設(shè)有2種濃度的PRF浸出液，觀察PRF對(duì)hPDLCs作用是否具有劑量依賴(lài)性。結(jié)果與以往研究結(jié)果有所差異，未表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，可能是PRF作用方式和PRF浸出液制備方法不同導(dǎo)致，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

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(2013-04-23 收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

Effects of platelet-rich fibrin on human periodontal ligament cells migration and osteogenetic differentiation

LIWei1)，LIKunyang2)，F(xiàn)ANYun3)，YUFangfang3)，CHENDong3)

1)DepartmentofStomatology,YiheHospital,ZhengzhouPeople’sHospital,Zhengzhou450008 2)DepartmentofPeriodontology,StomatologicalHospitalofZhengzhouCity，Zhengzhou450000 3)SchoolofStomatology,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

periodontal ligament cell; platelet-rich fibrin; migration; osteogenetic differentiation

Aim: To investigate the effects of platelet-rich fibrin(PRF) on the migration and osteogenetic differentiation of human periodontal ligament cells(hPDLCs), and to evaluate the potential value of PRF used in periodontal tissue regeneration. Methods: The hPDLCs were primarily cultured and the PRF was prepared. There were three groups: 1 piece of PRF group (P1 group), 2 pieces of PRF group (P2 group), and control group. The cell migration distances at the 24th, 48th, 72th h were recorded under microscope in scratches experiment. Transwell was used to prepare migration model, and the results were observed by crystal violet staining after 24 h. Alkaline phosphatase(ALP) activity was detected by the kits of ALP at three time points. hPDLCs were induced differentiation by osteogenesis mineralization fluid and to observe mineralized nodules after being cultured for 21 days. Results: Scratch experimental results showed that the cell migration distances of the experimental groups were significantly greater than that of the control group (F=316.248，32.846, and 1 169.847,P<0.001), but there was no significant difference between two experimental groups (P>0.05). Transwell migrating experiment showed that compared with control group, the cells of the experimental groups migrating to the outside of the Transwell chambers were significantly more than that of control group (F=742.729，P<0.001), but there was no significant difference between the two experimental groups (P>0.05). The ALP activity of P1 group and P2 group were significantly more than that of control group (F=474.202，1 383.521，2 317.965，P<0.001), but there was no significant difference between P1 group and P2 group (P>0.05). There were significant differences in mineralized nodule area between experimental groups and control group (F=332.280，P<0.001), but there was no significant difference between P1 group and P2 group(P>0.05). Conclusion: PRF could promote hPDLCs migration and osteogenetic differentiation, and PRF may have great potential value in clinical application of periodontal tissue engineering.

R781.4

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.031