BMP-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣含量的影響

張雁儒，張 輝，馬 輝，王義生

1)鄭州大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052 4)洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院骨科 471002

BMP-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶活性和鈣含量的影響

張雁儒1,2)，張 輝3)，馬 輝4)，王義生2)#

1)鄭州大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052 4)洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院骨科 471002

#通訊作者，男，1951年2月生，碩士，教授，研究方向：骨壞死的發(fā)病機(jī)制與防治、關(guān)節(jié)脊柱外科，E-mail:wangyisheng@zzu.edu.cn

骨形成蛋白2；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；堿性磷酸酶；鈣;兔

目的：觀察骨形成蛋白2(BMP-2)基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)堿性磷酸酶(ALP)活性和鈣含量的影響。方法成年大耳白兔16只，經(jīng)髂后上嵴抽取骨髓組織混合后培養(yǎng)、分離BMSCs。取第3代細(xì)胞，采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP-2質(zhì)粒。在擴(kuò)大培養(yǎng)的第7、14、21、28和35天時(shí)收集細(xì)胞，用相應(yīng)試劑盒對(duì)細(xì)胞ALP活性和鈣含量進(jìn)行測(cè)定，在擴(kuò)大培養(yǎng)的第21天采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞BMP-2 mRNA的表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照。結(jié)果轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為(1.652±0.082)，對(duì)照組為(0.473±0.021)，轉(zhuǎn)染組BMSCs中BMP-2 mRNA的表達(dá)明顯提高(t=2.192,P=0.005)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)ALP活性和鈣含量較對(duì)照明顯提高(P<0.01)。結(jié)論轉(zhuǎn)染BMP-2基因的BMSCs表現(xiàn)出明顯的成骨活性，可以應(yīng)用為骨組織工程研究的種子細(xì)胞。

細(xì)胞移植治療是近年來(lái)組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)有多向分化潛能，已大量應(yīng)用于肌肉、軟骨等組織工程。骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的新骨形成調(diào)控因子，具有誘導(dǎo)新骨形成的作用[1]。國(guó)內(nèi)外大量研究[2]表明BMP-2與BMSCs在新骨生成過程中發(fā)揮協(xié)同作用。該研究中，作者構(gòu)建了BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中堿性磷酸酶(alkaline phosphalase,ALP)活性和鈣含量，分析BMP-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs成骨活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料16只成年新西蘭大耳白兔，雌雄不限，兔齡4～6周，體重0.5～1.5 kg。pcDNA3.1-BMP-2質(zhì)粒由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心構(gòu)建。倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrgen公司)，胎牛血清、2.5 g/L胰蛋白酶溶液、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，青、鏈霉素溶液(華北制藥廠)，ALP活性檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞鈣含量檢測(cè)試劑盒和EDTA(廣州東盛生物科技有限公司)。

1.2BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定于兔髂后上嵴抽取骨髓組織，混合后種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打后加入地塞米松，振蕩，培養(yǎng)3 d后更換DMEM培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)孔面積的50%時(shí)，用胰蛋白酶處理，原孔傳代2～3 d；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后，吹打混勻，計(jì)數(shù)，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)；長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，用胰蛋白酶處理，配制細(xì)胞懸液，最后每50 μL細(xì)胞懸液復(fù)合于醫(yī)用明膠海綿上，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h備用[3]。取第2代細(xì)胞，利用免疫組化染色法檢測(cè)BMSCs表面抗原標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行鑒定[4]。取第3代細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。

1.3pcDNA3.1-BMP-2的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染組：取BMSCs，以1×104mL-1的濃度接種，用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 d后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106mL-1備用。取1 mL細(xì)胞懸液，加適量EDTA，移入直徑4 mm的電轉(zhuǎn)杯中，加入12 μg pcDNA3.1-BMP-2質(zhì)粒，簡(jiǎn)單吹打混勻后進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)參數(shù)：300 V，980 μF，二次脈沖，波形為方波/回旋波。在5 min內(nèi)電擊打并迅速冰浴，再加入37 ℃且含有體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后電轉(zhuǎn)，更換含有400 mg/L G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)3周[5]。對(duì)照組處理過程中不加入pcDNA3.1-BMP-2質(zhì)粒，其余與轉(zhuǎn)染組相同。兩組篩選培養(yǎng)后均再擴(kuò)大培養(yǎng)3周。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4細(xì)胞BMP-2mRNA的檢測(cè)擴(kuò)大培養(yǎng)的第21天，以GAPDH基因作為內(nèi)源性參照，采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞BMP-2 mRNA，操作步驟參考ABI 7500 fast擴(kuò)增儀和Premix Ex TaqTMTaqMan試劑盒說(shuō)明書。引物序列見表1，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增條件：92 ℃ 2 min；92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用Image J灰度分析軟件定量分析條帶灰度值，以BMP-2與GAPDH條帶灰度值的比值表示BMP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5細(xì)胞中ALP活性和鈣含量的測(cè)定在擴(kuò)大培養(yǎng)的第7、14、21、28和35天時(shí)收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)ALP活性進(jìn)行檢測(cè)，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)[6]；在擴(kuò)大培養(yǎng)的第14、21、28和35天時(shí)收集細(xì)胞，按照細(xì)胞鈣含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，于575 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值[7]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組細(xì)胞BMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組細(xì)胞ALP活性及鈣含量的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1BMSCs的生長(zhǎng)情況在顯微鏡下，新鮮細(xì)胞呈“滿天星”樣，無(wú)法辨認(rèn)細(xì)胞核。傳代過程中，經(jīng)胰蛋白酶消化后，細(xì)胞間隙增大，形態(tài)變圓并逐漸由圓形變?yōu)榫坏拈L(zhǎng)梭形；密度較高時(shí)，細(xì)胞呈漩渦狀或放射狀排列；細(xì)胞的貼壁率較高，傳代4 h后即可出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，快速增殖3～4 d后細(xì)胞即可進(jìn)行再次傳代；傳代培養(yǎng)的細(xì)胞外形更均一。第2、3代細(xì)胞增殖旺盛。第2代細(xì)胞經(jīng)鑒定確認(rèn)為BMSCs，見圖1。

圖1 培養(yǎng)成功的BMSCs(倒置相差顯微鏡,×100)

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果轉(zhuǎn)染組BMSCs的形態(tài)見圖2。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞BMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為(1.652±0.082)，對(duì)照組為(0.473±0.021)，轉(zhuǎn)染組BMSCs中BMP-2 mRNA高效表達(dá)(t=2.192,P=0.005)。

圖2 成功轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BMP-2的BMSCs(倒置相差顯微鏡，×100)

2.3兩組細(xì)胞ALP活性及鈣含量的比較見表1、2。

表1 兩組ALP活性的比較

F組間=2 269.808，P<0.001;F時(shí)間=588.941，P=0.003;F交互=104.167，P=0.004。

表2 兩組鈣含量的比較

F組間=1 703.214，P<0.001;F時(shí)間=292.348，P=0.003;F交互=4 431.468，P<0.001。

3 討論

BMPs是目前最重要的新骨形成調(diào)控因子，具有誘導(dǎo)新骨形成的作用，主要由成骨細(xì)胞和瘤性成骨細(xì)胞分泌，在體內(nèi)分布不多，主要分布于骨膠原纖維、骨膜、骨髓基質(zhì)中，皮質(zhì)骨的含量較松質(zhì)骨多[8-9]。BMPs是骨形成過程中惟一能獨(dú)立誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的調(diào)控因子[10]。研究[11]表明，低濃度的BMPs可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞移行至骨組織形成部位；中等濃度的BMPs能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞；高濃度的BMPs則可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增生。天然BMPs的獲得或純化均非常困難，目前通常采用基因重組技術(shù)大量制備rhBMP-2，rhBMP-2也被證實(shí)無(wú)論是正位還是異位均能誘導(dǎo)新生骨組織形成，這為臨床應(yīng)用BMP-2治療骨缺損等提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)[12-13]。

在臨床上， BMSCs取自于骨髓，手術(shù)操作簡(jiǎn)便，來(lái)源較充足。BMSCs可以在短期之內(nèi)以驚人的速度增殖，能使原始細(xì)胞數(shù)量在兩三周內(nèi)成千倍的增長(zhǎng)，并且免疫原性很低[14]。BMSCs是多種類型的再生醫(yī)學(xué)研究中首選的種子細(xì)胞，已經(jīng)顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景。

國(guó)內(nèi)外大量研究[15-16]表明，BMP-2與BMSCs在新骨生成過程中具有協(xié)同作用，通過在BMSCs中導(dǎo)入BMP-2基因并成功表達(dá)可以促進(jìn)新骨再生。該實(shí)驗(yàn)中，作者成功將BMP-2基因轉(zhuǎn)染入BMSCs，而且轉(zhuǎn)染的BMSCs成功表達(dá)BMP-2 mRNA。培養(yǎng)3～4 d后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著變化，由梭形逐漸變化為多角形，有的則轉(zhuǎn)為肥碩梭形，成骨分化趨勢(shì)顯著。轉(zhuǎn)染的BMSCs中ALP活性和鈣含量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步說(shuō)明BMP-2基因轉(zhuǎn)染在體外可誘導(dǎo)BMSCs向成骨方向分化。該結(jié)果為進(jìn)一步基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

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(2013-01-17 收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

Effect of BMP-2 gene transfection on alkaline phosphalase activity and calcium deposition in bone marrow mesenchymal stem cell of rabbits

ZHANGYanru1,2),ZHANGHui3),MAHui4),WANGYisheng2)

1)CenterofMedicalExperiment,InternationalEducationSchool,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2)DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

3)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)DepartmentofOrthopaedics,theThirdPeople’sHospitalofLuoyangCity,Luoyang471002

bone morphogenetic protein 2; bone marrow mesenchymal stem cell; alkaline phosphalase; calcium; rabbit

Aim: To investigate the changes of alkaline phosphalase(ALP) activity and calcium deposition of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) transfected with BMP-2 gene. Methods: The bone marrow were extracted from posterior superior iliac spine of 16 adult rabbits,and mixed to be cultured.BMSCs were obtained and transfected with pcDNA3.1-BMP-2.At the 7th,14th,21st,28th and 35th day during the amplification culture,ALP activity and calcium deposition were detected;at the 21st day, BMP-2 mRNA was detected using RT-PCR. The BMSCs without transfection were the control.Results: The expression of BMP-2 mRNA was (1.652±0.082) in transfected BMSCs, and (0.473±0.021) in the control BMSCs,and the difference between them was significant(t=2.192,P=0.005). ALP activity and calcium deposition of transfected cells were higher than those of the control(P<0.01).Conclusion: BMSCs transfected with BMP-2 gene show obvious osteogenic activity,and could be used as seed cells for bone engineering research.

R681

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.029