吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達(dá)的影響*

杜芳宇，劉劍波

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達(dá)的影響*

杜芳宇，劉劍波#

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

#通訊作者，男,1964年2月生,博士,教授,主任醫(yī)師,研究方向：哮喘的發(fā)病機制和防治，E-mail:jbliuzz@yahoo.com.cn

A型γ-氨基丁酸受體α亞單位; MUC5AC; 吡格列酮; 哮喘；小鼠

目的：觀察吡格列酮對哮喘小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC表達(dá)的影響。方法30只成年BALB/C小鼠隨機分為3組，每組10只。哮喘組和吡格列酮干預(yù)組以卵白蛋白(OVA)致敏、激發(fā)制作哮喘小鼠模型，吡格列酮干預(yù)組于每次激發(fā)前30 min霧化吸入吡格列酮5×10-5mol/L，對照組以生理鹽水代替OVA處理。末次激發(fā)后24 h處死小鼠，取肺組織行HE染色觀察氣道病理學(xué)表現(xiàn)，采用免疫組化SP法、RT-RCR法檢測肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果哮喘組小鼠氣道黏膜下充血水腫，黏膜層增厚，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤；吡格列酮干預(yù)組上述表現(xiàn)較哮喘組減輕。哮喘組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白和mRNA的表達(dá)水平均較對照組高，吡格列酮干預(yù)組較哮喘組降低，但仍高于對照組(P均<0.05)。結(jié)論吡格列酮可能通過下調(diào)GABAARα的表達(dá)在哮喘氣道黏液過度分泌中起治療作用。

炎癥、重構(gòu)及黏液高分泌是支氣管哮喘的重要病理表現(xiàn)。吡格列酮是過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors γ,PPARγ)激動劑。研究[1-2]顯示PPARγ激動劑除可明顯抑制促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的產(chǎn)生外，還可抑制哮喘模型小鼠肺嗜酸粒細(xì)胞及氣道高反應(yīng)性。A型γ-氨基丁酸受體(γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR)屬受體門控離子受體超家族，α亞單位在GABAAR復(fù)合物的組裝和功能中可能起主要作用。近來研究[3]發(fā)現(xiàn)GABA合成酶和GABAAR在氣道上皮細(xì)胞表達(dá),而且哮喘時表達(dá)增強,伴有黏液過度分泌。MUC5AC由氣道杯狀細(xì)胞分泌，反映了氣道黏液分泌的情況。該實驗旨在研究吡格列酮干預(yù)后哮喘模型小鼠肺組織GABAARα和MUC5AC表達(dá)水平的變化,探討哮喘時氣道黏液過度分泌的發(fā)生機制,并為哮喘的早期干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器卵白蛋白(OVA，Sigma公司)，鹽酸吡格列酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司惠贈)，小鼠抗MUC5AC單克隆抗體、小鼠抗GABAARα單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Trizol試劑、RT-PCR 試劑盒(Transgene公司)，超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，德國Lecia顯微照像系統(tǒng)，PCR擴增儀(Eppendorf公司)，D-140圖像記錄分析系統(tǒng)(大連競邁生物科技有限公司)。

1.2實驗分組及處理6～8周齡清潔級BALB/C小鼠30只，體重18～22 g，購自河南省實驗動物中心。按隨機數(shù)字表法分為3組：對照組、哮喘組和吡格列酮干預(yù)組，每組10只。實驗第1天和第8天，哮喘組及吡格列酮干預(yù)組小鼠腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液0.2 mL[含OVA 50 μg和Al(OH)35 mg]致敏,從實驗第15天開始以20 g/L OVA霧化吸入30 min/d激發(fā)，連續(xù)7 d；吡格列酮干預(yù)組于OVA霧化吸入前30 min霧化吸入吡格列酮(5×10-5mol/L)；對照組以生理鹽水代替OVA致敏、激發(fā)。末次激發(fā)后24 h，體積分?jǐn)?shù)5%的水合氯醛400 mg/kg麻醉小鼠，打開胸腔，結(jié)扎右肺門根部，生理鹽水0.3 mL行左肺支氣管肺泡灌洗，共3次，合并得支氣管肺泡灌洗液(BALF)。取右肺組織浸入體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋制成蠟塊，切片后部分行HE染色，部分用于免疫組化檢測。切取左肺葉迅速放入液氮中，速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中用于RT-PCR檢測。

1.3BALF細(xì)胞計數(shù)取150 μL BALF 細(xì)胞懸液與細(xì)胞計數(shù)液按11稀釋混勻，顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，其余BALF 4 ℃、2 000 r/min離心10 min，沉淀物涂片，行瑞氏染色，每個標(biāo)本計數(shù)200個細(xì)胞。

1.4肺組織病理學(xué)觀察取肺組織切片，常規(guī)HE染色，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)、氣道上皮損傷、氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.5肺組織GABAARα和MUC5AC蛋白的檢測采用免疫組化SP法。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水洗后，檸檬酸修復(fù)抗原，用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，小鼠抗MUC5AC單克隆抗體、小鼠抗GABAARα單克隆抗體按150稀釋。實驗按試劑盒說明步驟操作。陽性部位呈棕褐色。采用圖像積分光密度分析軟件進(jìn)行圖像分析，取平均積分光密度值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6肺組織GABAARα和MUC5ACmRNA的檢測采用RT-PCR法。GABAARα上游引物5’-CAAAGCTCGGATAGGAGAC-3’，下游引物5’-CACT GGTGGGTGGAATGAC-3’，擴增片段大小為167 bp。MUC5AC上游引物5’-TGATGGCCTAGTTGTTGAGC-3’，下游引物5’-ATCTGGCGGAGCAGTTCTT-3’，擴增片段大小為368 bp。GAPDH上游引物5’-ACG GCAAATTCAACGGCACA-3’，下游引物5’-AGGCG GCACGTCAGATCCAC-3’ ，擴增片段大小為589 bp。取約100 mg肺組織，研磨后加入Trizol 1 mL，參照說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2 μL cDNA為模板行PCR。擴增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(GABAARα及MUC5AC為56 ℃，GAPDH為58 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因與內(nèi)參條帶灰度值之比作為目的基因的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。3組間BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)和肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白及mRNA表達(dá)的比較采用單因素方差分析，多組樣本均數(shù)兩兩比較，方差齊者用LSD-t檢驗，方差不齊者用Dunnett’s T3 法檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)比較見表1。

表1 3組BALF細(xì)胞總數(shù)和嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)×109 L-1

*:與對照組比較，P<0.05；#:與吡格列酮干預(yù)組比較，P<0.05。

2.2 3組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)HE染色見：對照組小鼠氣道黏膜上皮正常，氣道周圍無明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整；哮喘組小鼠氣道黏膜上皮局部脫落，黏膜下充血水腫，黏膜層增厚，支氣管壁及血管壁周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤；吡格列酮干預(yù)組黏膜上皮相對完整，黏膜下充血水腫、氣道壁增厚及炎性細(xì)胞浸潤較哮喘組減輕。見圖1。

2.3 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白的表達(dá)GABAARα蛋白主要表達(dá)于氣道上皮，在基底部無表達(dá)，陽性表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜；MUC5AC陽性染色僅見于支氣管上皮細(xì)胞，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)可見棕褐色顆粒。哮喘組肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白表達(dá)強于吡格列酮干預(yù)組，且二者均高于對照組。見圖1和表2。

圖1 3組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)及GABAARα和MUC5AC蛋白的表達(dá)

A：對照組；B：哮喘組；C：吡格列酮干預(yù)組；1：肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，×400)；2：肺組織中GABAARα蛋白的表達(dá)(SP，×400)；3：肺組織中MUC5AC蛋白的表達(dá)(SP，×400)。

表2 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC蛋白的表達(dá)

*:與對照組比較，P<0.05；#:與吡格列酮干預(yù)組比較，P<0.05。

2.4 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5ACmRNA的表達(dá)哮喘組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA的相對表達(dá)量均高于吡格列酮干預(yù)組，且二者都高于對照組。見圖2和表3。

圖2 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA的表達(dá)

表3 3組小鼠肺組織GABAARα、MUC5ACmRNA的表達(dá)

組別nGABAARαmRNAMUC5ACmRNA對照組100．33±0．080．50±0．52哮喘組100．88±0．14?#0．93±0．17?#吡格列酮干預(yù)組100．70±0．11?0．71±0．57?F49．92933．937P<0．001<0．001

*:與對照組比較，P<0.05；#:與吡格列酮干預(yù)組比較，P<0.05。

3 討論

吡格列酮作為胰島素增敏劑，廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療。其作用機制是高選擇性地激動PPARγ，PPARγ的活化可調(diào)節(jié)許多控制葡萄糖及脂類代謝的胰島素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。近來研究[1-2，4]顯示，PPARγ作為調(diào)節(jié)糖代謝及脂類的轉(zhuǎn)錄因子，與2型糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化及腫瘤等慢性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，其還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和廣泛的抗炎作用。有研究[5]證實PPARγ激動劑能抑制A549細(xì)胞釋放趨化因子和細(xì)胞因子，降低IgE水平，減少黏液產(chǎn)生、膠質(zhì)沉積，減輕哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性。

氣道黏液高分泌在哮喘的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。MUC5AC起調(diào)控氣道黏蛋白合成的作用，反映了氣道黏液分泌的情況。GABA 是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究[6-7]表明GABA受體和GABA合成酶谷氨酸脫羧酶在氣道上皮細(xì)胞中有表達(dá)，且組成了一個完善的GABA 系統(tǒng)；此系統(tǒng)參與了杯狀細(xì)胞的增生和黏液的過度分泌。GABAAR的抑制減少了哮喘發(fā)作時氣道上皮細(xì)胞黏液的分泌，并且抑制了氣道重塑[8-9]。

氣道炎癥及氣道重構(gòu)是支氣管哮喘的重要病理表現(xiàn)。該實驗采用吡格列酮對哮喘模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示OVA激發(fā)的哮喘小鼠氣道和肺組織中出現(xiàn)了明顯的炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)改變，如嗜酸粒細(xì)胞為主的炎癥反應(yīng)、黏液分泌增加以及氣道壁增厚為主的氣道重構(gòu)；而吡格列酮干預(yù)組以上表現(xiàn)較哮喘組減輕，提示吡格列酮可能存在抗炎及抑制氣道重構(gòu)的作用，此種作用可能通過抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和TLR2表達(dá)，使TLR誘導(dǎo)的核因子NF-κB活性降低,下調(diào)趨化因子表達(dá)而實現(xiàn)[10]。作者觀察到哮喘組肺組織GABAARα、MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)水平均較對照組高，吡格列酮干預(yù)后以上指標(biāo)均降低，GABAARα與MUC5AC變化趨勢一致。由此推斷，吡格列酮減輕氣道黏液過度分泌的過程可能涉及GABAARα, 這對于解釋哮喘的發(fā)病機制具有重要意義。吡格列酮可能通過下調(diào)GABAARα的表達(dá)在哮喘氣道黏液過度分泌中起治療作用，但是GABAARα的表達(dá)變化是吡格列酮直接調(diào)控的效果，還是由于吡格列酮抑制TLR-NF-κB信號通路激活、下調(diào)趨化因子表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生的間接調(diào)控作用，仍需要進(jìn)一步的研究。

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(2013-06-25 收稿 責(zé)任編輯 徐春燕)

Influence of pioglitazone on expressions of GABAARα and MUC5AC in lung tissue of asthmatic mice

DUFangyu,LIUJianbo

DepartmentofRespiratoryDisease,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

GABAARα; MUC5AC;pioglitazone; asthma；mouse

Aim: To observe the effects of pioglitazone on the expressions of GABAARα and MUC5AC in lung tissue of asthmatic mice, and to explore new ideas for prevention and treatment of asthma. Methods: Thirty BALB/C mice were randomly allocated into 3 groups(n=10):normal control group,the asthma group,and the pioglitazone intervention group. The latter 2 groups were established asthma model by sensitized and challenged with ovalbumin.The pioglitazone intervention group was given aerosol inhalation of pioglitazone 30 min before each allergen challenge. The pathological changes of the lung tissue were observed by HE staining. The expressions of GABAARα, MUC5AC mRNA and protein in lung tissue were analyzed by RT-RCR and immunohistochemistry. Results: The mice in the asthma group showed mucosal hyperemia and edema, mucosa thickening and severe airway inflammation. These changes alleviated in the pioglitazone intervention group．The expressions of GABAARα,MUC5AC protein and mRNA in the asthma group were higher than those of normal control group(P<0.05),and compared with those of the asthma group, the above indexes in the pioglitazone intervention group decreased but still higher than those in normal control group(P<0.05).Conclusion: Pioglitazone may play a role in the treatment of excessive mucus production through down-regulating the expression of GABAARα.

*河南省科技廳重點科技攻關(guān)項目 122102310236

R562.2+5

10.3969/j.issn.1671-6825.2014.01.010