評價肺炎鏈球菌疫苗免疫效果的功能性抗體檢測方法的建立

李江姣 杜慧竟 石繼春 徐苗 葉強

[摘要] 目的 建立肺炎球菌疫苗免疫效果評價的功能性抗體滴度檢測方法。 方法 參考美國阿拉巴馬大學(xué)的多重調(diào)理吞噬實驗（MOPA）方法，構(gòu)建并鑒定HL-60效應(yīng)細胞庫、肺炎球菌工作菌種庫和補體；在此基礎(chǔ)上對5份血清樣本進行調(diào)理吞噬活性檢測。 結(jié)果 HL-60細胞分化后表面標志表達量CD35為71.78%，CD71為10.97%，活細胞比例為72.96%。13個血清型的肺炎鏈球菌工作菌種的凍存復(fù)活率均高于90%；抗生素抗性與敏感性與預(yù)期結(jié)果一致；工作稀釋度均≥1000。補體的非特異性殺菌率均≤70%。血清樣本的殺菌曲線均為標準的S型，平行孔間的差異不超過3倍。 結(jié)論 效應(yīng)細胞、工作菌種、補體及血清樣本的檢測結(jié)果均符合阿拉巴馬大學(xué)參考方法的標準要求，成功建立了基于MOPA的功能性抗體檢測方法。

[關(guān)鍵詞] 肺炎鏈球菌；疫苗；功能抗體；調(diào)理吞噬試驗

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）07（b）-0004-05

肺炎鏈球菌可以引起肺炎、菌血癥、腦膜炎、中耳炎等疾病，是兒童和老年人獲得性感染的主要病原菌[1]；接種肺炎鏈球菌疫苗可以有效預(yù)防肺炎鏈球菌感染[2]。為了保證疫苗質(zhì)量，所有肺炎鏈球菌疫苗上市前均需對其免疫保護效力進行測定。目前針對該疫苗，普遍采用的體外效力檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），利用抗原-抗體的特異性結(jié)合特性對待測血清中的抗體水平進行檢測[3]；但該類方法只能檢測抗體的總含量，無法將功能性抗體甄別出來，不能真實反映疫苗的免疫保護效果。事實上，對于一些特殊人群，如老年人和免疫系統(tǒng)不完善的人群，接種疫苗后產(chǎn)生的抗體往往是非功能性抗體，不能發(fā)揮免疫保護作用[4-5]。可見，如果單純以抗體含量來評估疫苗質(zhì)量，很可能無法準確鑒定疫苗的保護效力。因此，迫切需要建立能夠準確反映功能性抗體含量的檢定方法，以便能夠正確評估肺炎鏈球菌疫苗的保護效力和質(zhì)量。

肺炎球菌疫苗的保護機制主要是通過特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用將體內(nèi)的肺炎球菌清除。所謂調(diào)理吞噬作用是指抗體、補體與吞噬細胞表面結(jié)合，促進吞噬細胞吞噬細菌等顆粒性抗原的作用。由此可見，注射疫苗后只有機體產(chǎn)生能夠有效介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用的功能性抗體，才能發(fā)揮真正的免疫保護作用。通過體外調(diào)理吞噬實驗（opsonophagocytic assay，OPA）檢測抗體的調(diào)理吞噬活性，能夠直接反映功能性抗體含量，實現(xiàn)對疫苗保護效力的準確評估[6]。已有多項研究表明，OPA與疫苗臨床有效性的相關(guān)性要高于ELISA[7-8]。

近年來，國際上多個實驗室開始致力于OPA技術(shù)的研發(fā)，試圖建立一套穩(wěn)定、可靠、標準化的檢測方法。美國阿拉巴馬大學(xué)通過長期探索，建立了優(yōu)化的多重調(diào)理吞噬實驗（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同時對4種血清型的肺炎球菌功能抗體進行檢測，簡化了實驗流程，減少了工作量并節(jié)約血清樣本，提高了OPA技術(shù)的檢測通量[9]。并且國外部分藥企已經(jīng)開始采用OPA方法進行肺炎鏈球菌疫苗的臨床效力評價[8，10-11]。但由于該方法操作較為復(fù)雜，技術(shù)要求高，目前國內(nèi)該方法的研究和應(yīng)用比較缺乏。本研究參考美國阿拉巴馬大學(xué)大學(xué)的MOPA實驗，結(jié)合國內(nèi)的實際情況，旨在建立一套適合我國應(yīng)用的肺炎鏈球菌疫苗效力評價方法。

1 材料與方法

1.1 材料

HL-60細胞系購自美國ATCC（CCL-240）；13個血清型的肺炎鏈球菌菌株（帶有特定抗生素抗性）來源于美國阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校Moon H Nahm實驗室；5份血清樣本來源于23價肺炎球菌多糖疫苗免疫后的健康人群；SPF級新西蘭乳兔（3～4周齡）由中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室提供。

1.2 試劑

BactoTMTodd Hewitt Broth（THB）（批號：3071477）、酵母提取物（批號：2220095）購自Becton Dickinson公司；RPMI1640（批號：1393807）、胎牛血清（批號：1428479）購自Gibco公司；二甲基甲酰胺（DMF）（批號：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（批號：2532B313）購自Amresco公司；Anti-CD11b PE（批號：2184659）、Anti-CD35PE（批號：2326940）、Anti-CD71 PE（批號：2292633）、Annexin V FITC（批號：2202518）、Propodium Iodide（PI）（批號：SLBB4626V）和Annexin V Binging Buffer（批號：30435）購自BD Pharmingen公司；4種抗生素：奧普脫欣（Optochin，批號：051M1257V）、奇霉素（Spectinomycin，批號：102K05447V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBC9232V）、鏈霉素（Streptomycin，批號：2036B318）購于Sigma公司。

1.3 儀器

菌落計數(shù)器（型號：ProtoCOL 3）購自英國Synbiosis公司；流式細胞儀（型號：FACS Calibur）購自美國BD公司。

1.4 HL-60細胞的培養(yǎng)及主代細胞庫的建立

從ATCC購買的原始HL-60細胞經(jīng)復(fù)蘇、增殖培養(yǎng)、再凍存建立一個主代細胞庫（80管）。

1.5 HL-60細胞的分化及鑒定

使用DMF誘導(dǎo)HL-60細胞分化5 d，用流式細胞儀進行檢測。具體分化步驟及鑒定方法參考文獻[12]。

1.6 肺炎鏈球菌工作種子批的制備及鑒定

1.6.1 肺炎鏈球菌工作種子批的制備 來源于美國阿拉巴馬大學(xué)的各型肺炎鏈球菌，37℃培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)移至THY液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.9，收集培養(yǎng)液加80%甘油混勻后分裝凍存，制備工作種子批。

1.6.2 凍存菌種活力檢測 將凍存菌種與未經(jīng)冷凍的細菌同步稀釋后，37℃過夜培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)，計算冷凍細菌的復(fù)活率。

1.6.3 凍存細菌抗生素抗性及敏感性檢測 在分別含4種抗生素（奧普脫欣、奇霉素、鏈霉素、甲氧芐氨嘧啶）的培養(yǎng)基和不加抗生素的對照培養(yǎng)基中，劃線接種13個型的肺炎鏈球菌，37℃培養(yǎng)過夜后進行觀察。

1.6.4 凍存細菌工作稀釋度的確定 按照參考文獻[12]的方法進行工作稀釋度的測定。選擇菌落數(shù)為80～120 cfu/spot的稀釋度作為最佳稀釋度。

1.7 補體制備及鑒定

取SPF級新西蘭乳兔頸動脈采血獲得補體，按照文獻[12]的方法測定該批次補體的非特異性殺菌率。

1.8 調(diào)理吞噬試驗

將待測血清在56℃水浴中滅活30 min，按照參考文獻[12]的方法進行操作。經(jīng)菌落計數(shù)后，用軟件Opsotiter3計算樣本的調(diào)理吞噬滴度。

2 結(jié)果

2.1 HL-60細胞的表面標志鑒定和活力測定

經(jīng)測定，未分化的HL-60細胞表面標志表達量：CD35為7.03%，CD71為88.87%，活細胞比例為88.89%（圖1）。HL-60細胞在誘導(dǎo)分化5 d后表面標志表達量：CD35為71.78%，CD71為10.97%，活細胞比例為72.96%（圖2）。阿拉巴馬大學(xué)參考方法的標準規(guī)定，分化后活性細胞比例應(yīng)≥65%，CD35表達應(yīng)≥55%，CD71表達應(yīng)≤20%。本實驗測得的各項指標均符合阿拉巴馬大學(xué)參考方法的各項質(zhì)量標準，可用作OPA實驗的效應(yīng)細胞。

2.2 肺炎鏈球菌工作菌種的鑒定

2.2.1 凍存工作種子的復(fù)活率 結(jié)果顯示，13個血清型的凍存肺炎鏈球菌工作菌種的復(fù)活率分別為：1型94%，3型92%，4型96%，5型95%，6A型94%，6B型93%，7F型91%，9V型93%，14型94%，18C型94%，19A型95%，19F型96%，23F型95%，均高于90%。

2.2.2 工作菌種的抗生素抗性與敏感性檢測 結(jié)果顯示，各型工作菌種均只具有其特定的抗生素抗性，對其余3種抗生素均為敏感。見圖3。

2.2.3 工作菌種的工作稀釋度確定 13個血清型的凍存肺炎鏈球菌工作菌種的稀釋倍數(shù)分別為：1型3333×，3型6250×，4型2000×，5型16666×，6A型6250×，6B型3030×，7F型6666×，9V型1250×，14型1250×，18C型1470×，19A型10000×，19F型6250×，23F型6250×，均符合阿拉巴馬大學(xué)標準中稀釋倍數(shù)應(yīng)≥1000的要求。每個血清型對應(yīng)的稀釋條件下，存活的細菌數(shù)為80～120 cfu/spot。

2.3 補體的非特異性殺菌率

經(jīng)計算，制備的補體非特異性殺菌率：1型為7%，3型為9%，4型為35%，5型為1%，6A型為58%，6B型為57%，7F型為12%，9V型為36%，14型為35%，18C型為1%，19A型為5%，19F型為4%，23F型為47%。符合阿拉巴馬大學(xué)標準中非特異性殺菌率應(yīng)≤70%的質(zhì)量標準。

2.4 血清樣本的調(diào)理吞噬指數(shù)檢測

2.4.1 殺菌曲線 5份血清樣本的殺菌曲線見圖4。圖中可見，各血清樣本針對各型肺炎球菌的殺菌曲線均為標準的S型曲線。

2.4.2 調(diào)理指數(shù) 經(jīng)菌落計數(shù)及軟件Opsotiter 3的計算，各血清樣本的調(diào)理指數(shù)結(jié)果見表1。

3 討論

OPA實驗中涉及四個主要元素：效應(yīng)細胞、靶菌、補體及抗體血清，缺一不可，對于試驗的成敗都非常重要。本試驗中，效應(yīng)細胞選用的是HL-60細胞株（人早幼粒白血病細胞）。通過懸浮培養(yǎng)，HL-60細胞能持續(xù)增殖，人為誘導(dǎo)后可以分化為成熟的中性粒細胞，具有吞噬能力[13]。HL-60細胞在未分化和分化后表面標志物的表達情況會發(fā)生變化，如CD71和CD35。CD71蛋白在細胞增殖中發(fā)揮重要作用，其表達情況可以指示細胞的增殖狀態(tài)；CD35是一種跨膜的補體結(jié)合蛋白，存在于成熟的粒細胞表面，其表達情況可以顯示細胞的分化程度。HL-60細胞未分化之前，CD71的表達量較高，細胞具有較強的增殖能力；分化后CD71的表達量降低，細胞增殖能力減弱，CD35的表達量升高，細胞進入分化后的成熟粒細胞狀態(tài)。利用流式細胞儀對細胞表面標志物的表達情況進行監(jiān)測，可以實現(xiàn)對細胞分化程度的判斷。HL-60細胞的活性及分化程度越高，吞噬能力越強。

MOPA實驗中的靶菌，是帶有特定抗生素抗性的各型肺炎鏈球菌。將靶菌按抗性不同進行分組，每組中的4種靶菌分別攜帶不同的抗性。利用這一特點，可同時對4種血清型的肺炎球菌進行功能抗體檢測。制備工作菌種后，對各型菌種的特定抗生素抗性及敏感性進行確認非常重要。此外，為了保證試驗數(shù)據(jù)的準確性，需要確保對照孔中的活性細菌數(shù)在70～180 cfu范圍之內(nèi)；因此對工作菌種的凍存活力及工作稀釋度的核實也必不可少。

補體在OPA實驗中同樣處于重要地位。補體除了與型特異性抗體協(xié)作共同參與調(diào)理吞噬作用之外，其本身還具有一定的非特異性殺菌能力。如果補體自身的非特異性殺菌力太強，會使特定型別的靶菌被大量殺死，導(dǎo)致試驗失敗。因此試驗中需要先對補體的非特異性殺菌率進行測定，必要時需要對不同批次補體進行篩選。血清樣本在試驗前需要進行滅活補體的處理，還需要檢測是否含有抗生素，從而排除對試驗的干擾。血清樣本恰當(dāng)?shù)念A(yù)稀釋倍數(shù)十分關(guān)鍵，根據(jù)實際情況需要進行調(diào)整，如果預(yù)稀釋倍數(shù)太高，容易導(dǎo)致殺菌不徹底，影響試驗結(jié)果的準確性，而預(yù)稀釋倍數(shù)太低，則容易導(dǎo)致殺菌率太高，無法檢出具體的調(diào)理滴度。

本研究中，HL-60細胞檢測結(jié)果顯示，分化5 d后活細胞比例為72.96%，CD35的表達量為71.78%，CD71的表達量為10.97%，符合MOPA參考試驗的標準要求。工作菌種檢測結(jié)果顯示，工作菌種的凍存活力均高于90%，抗生素抗性與敏感性與預(yù)期結(jié)果一致，工作稀釋度均≥1000，符合標準要求。補體的檢測結(jié)果顯示，非特異性殺菌率均≤70%，符合要求。對5份血清樣本的檢測結(jié)果顯示，兩平行樣本孔間的差異<3倍，殺菌曲線均為標準的S型曲線，符合MOPA試驗各項要求。上述結(jié)果表明，本研究已經(jīng)成功建立了MOPA檢測方法。

OPA技術(shù)在國際上已被多個大型制藥企業(yè)用來進行肺炎球菌疫苗的臨床免疫效果評價，WHO也已推薦使用OPA技術(shù)進行疫苗的功能性抗體檢測[14-15]，OPA技術(shù)的應(yīng)用已然成為肺炎疫苗臨床評價領(lǐng)域的一個發(fā)展趨勢。本研究在中國食品藥品檢定研究院建立了基于MOPA技術(shù)的肺炎球菌疫苗功能抗體檢測方法，對于促進國內(nèi)肺炎疫苗臨床評價水平的提高有重要意義。

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（收稿日期：2014-04-09 本文編輯：程 銘）