Stathmin及Cathepsin B在結(jié)直腸癌中的表達

楊正多 張丹 呂宏程 張麗 劉光 馬卉 王剛 張詩武

結(jié)直腸癌是人類常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居第四位[1]。腫瘤易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移而療效較差，因此探討與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)機制對其早期診斷、早期治療及預(yù)后至關(guān)重要。細胞周期調(diào)控是腫瘤研究的熱點之一，細胞周期相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)失控與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Stathmin蛋白是一種微管不穩(wěn)定蛋白，主要通過磷酸化和去磷酸化作用來調(diào)節(jié)細胞微管系統(tǒng)的動力學(xué)平衡與穩(wěn)定，控制細胞周期并調(diào)節(jié)細胞生物學(xué)行為[2]。Stathmin在人體正常組織中幾乎不表達，但在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，如乳腺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、肺癌[5]、喉鱗狀細胞癌[6]、內(nèi)分泌腫瘤[7]和卵巢癌[8]等，其表達水平的高低對腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者生存預(yù)后有重要影響。組織蛋白酶(Cathepsin)是位于溶酶體內(nèi)的一種半胱氨酸蛋白酶超家族，其活性與相應(yīng)前體蛋白的剪切密切相關(guān)。Cathepsin B是該蛋白酶超家族的重要成員之一，其重要的生物學(xué)功能之一是作為淀粉樣前體蛋白分泌酶參與淀粉樣前體蛋白的分解加工，與阿爾茲海默病的發(fā)生具有密切關(guān)系[9-10]。Cathepsin B還可能介導(dǎo)了一條非caspase的凋亡通路，調(diào)控腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程。近年來大量科研報道表明Cathepsin B與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌[11]，食管癌[12]，子宮內(nèi)膜癌[13]以及結(jié)直腸癌[14]等。本文利用158例結(jié)直腸癌患者的臨床病理切除標本及64例轉(zhuǎn)移灶的石蠟包埋組織制成組織芯片，利用免疫組織化學(xué)方法檢測二者的表達及其與腫瘤臨床病理分級間的聯(lián)系，為探討結(jié)直腸癌患者臨床病理分級的有用指標提供實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

一、一般資料

收集南開大學(xué)人民醫(yī)院病理科2009年-2013年手術(shù)切除、臨床病理資料完整的結(jié)直腸癌組織存檔蠟塊158例及64例轉(zhuǎn)移灶組織(發(fā)病年齡20歲-86歲，中位年齡61歲)，所有患者術(shù)前均未接受放射、化學(xué)藥物等抗腫瘤治療。按照WHO分級標準對結(jié)直腸癌病例進行組織學(xué)分級和TNM分期。

二、試劑和方法

濃縮型兔抗人Cathepsin B多克隆抗體(clone：BA-0428，1：50，Boster Tec.，Wuhan)；即用型兔抗人Stathmin單克隆抗體(clone：RMA-0641，Maixin Bio，F(xiàn)uzhou),抗鼠或兔即用型免疫組化Maxvision二抗(Kit-5020,Maixin Bio.，F(xiàn)uzhou)。DAB顯色系統(tǒng)購自北京中杉金橋生物公司。免疫組織化學(xué)染色采用S-P二步法，均采用檸檬酸鈉緩沖液(0.01 M,pH=6.0)高溫高壓修復(fù)，PBS代替一抗作陰性對照。

復(fù)查HE染色切片，用定位器對蠟塊上具有代表性的組織區(qū)域進行定位標記，每例組織選擇2-3個位點；使用全自動組織芯片制備儀制作每個位點直徑為1.5 mm的組織芯片，4 um厚連續(xù)切片，分別行HE染色和免疫組化檢測。

三、結(jié)果判定

高分化及中分化結(jié)直腸癌組織中Stathmin和Cathepsin B以細胞膜和/或細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，低分化結(jié)直腸癌組織中Stathmin和Cathepsin B以細胞膜和/或細胞漿以及細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，光鏡下觀察陽性細胞的數(shù)量，采用染色指數(shù)計數(shù)法。每張切片隨機選擇5個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個以上腫瘤細胞。根據(jù)腫瘤細胞陽性個數(shù)和染色強度綜合評價免疫組化結(jié)果。染色強度方面，腫瘤細胞胞漿或胞核無明顯染色計1分，染成淺黃色計2分，深棕黃色計3分；陽性細胞數(shù)方面：陽性腫瘤細胞數(shù)<25%，計0分；陽性腫瘤細胞數(shù)≥25%且<50%，計1分；陽性腫瘤細胞數(shù)為≥50%且<75%，計2分；陽性腫瘤細胞數(shù)≥75%，計3分。染色指數(shù)為染色強度和染色陽性細胞數(shù)乘積。乘積≥4者為陽性，0～3為陰性[15]。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用四格表確切概率法及Pearsonχ2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

Stathmin蛋白陽性信號主要位于細胞膜和/或細胞質(zhì)(圖1a～c)。Stathmin蛋白在高分化結(jié)直腸組織中表達陽性率為53.8%，在中分化腫瘤組織中表達陽性率為56.4%，在低分化腫瘤組織中表達陽性率為64.7%，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.369，P=0.504)。在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中，Stathmin蛋白在高分化組織中表達陽性率為14.3%，在中分化腫瘤組織中表達陽性率為22.2%，在低分化腫瘤組織中表達陽性率為56.4%，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(分別為χ2=4.212，P=0.040和χ2=5.803，P=0.016，圖2)。Stathmin蛋白在低分化結(jié)直腸癌細胞核陽性表達(圖1d)。

Cathepsin B蛋白陽性信號主要位于細胞膜或細胞質(zhì)(圖1e～g)。Cathepsin B蛋白在高分化結(jié)直腸組織中表達陽性率為39.2%，在中分化腫瘤組織中表達陽性率為83.6%，在低分化腫瘤組織中表達陽性率為90.4%，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(分別為χ2=22.223，P=0.000和χ2=29.651，P=0.001)。在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶中，Cathepsin B蛋白在高分化組織中表達陽性率為85.7%，在中分化腫瘤組織中表達陽性率為83.3%，在低分化腫瘤組織中表達陽性率為74.4%，差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.845，P=0.655，圖3)。Cathepsin B蛋白在低分化結(jié)直腸癌細胞核陽性表達(圖1h)。

討 論

目前關(guān)于細胞周期及其調(diào)控機制在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用的研究已經(jīng)取得很大進步，細胞周期的調(diào)節(jié)失控與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細胞周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDKs)以及周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDK-inhibitors，CDKIs)對細胞周期進行著嚴格調(diào)控。Stathmin蛋白是一種重要的微管解聚蛋白，在細胞周期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化來促進微管的解聚或阻止微管的聚合，Stathmin磷酸化水平與微管的平衡狀態(tài)及細胞周期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[16]。在細胞外基質(zhì)中，磷酸化可以降低Stathmin的活性，因此，降低Stathmin磷酸化的點突變可以減弱細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性，增加腫瘤細胞侵襲能力[17]，提示Stathmin在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Stathmin蛋白的高表達對腫瘤細胞的遷移和腫瘤患者生存預(yù)后都有重要影響。因此，Stathmin可能成為腫瘤治療的新靶點。

Belletti等[18]研究結(jié)果顯示Stathmin蛋白的過表達可促進軟組織肉瘤細胞發(fā)生局部組織浸潤和遠處轉(zhuǎn)移。Singer等[19]報道稱在非小細胞肺癌中，Stathmin過表達可以加快腫瘤細胞分裂增殖和基質(zhì)浸潤，增加細胞遷移運動。Zheng等[4]研究結(jié)果表明結(jié)直腸癌患者中Stathmin均高表達，并且發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中Stathmin表達水平更高，發(fā)生轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移的患者組織中，Stathmin的表達有明顯差異，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究所得到的相關(guān)結(jié)果顯示Stathmin蛋白在不同分化的結(jié)直腸癌組織中均表達上調(diào)，并且其高表達與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與上述文獻報道結(jié)果相符。

注：a圖為Stathmin蛋白在高分化結(jié)直腸癌組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像，陽性部位定位于腫瘤細胞膜或包漿；b圖為Stathmin蛋白在中分化結(jié)直腸癌組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像，陽性部位定位于腫瘤細胞膜、包漿或包核；c圖為Stathmin蛋白在低分化結(jié)直腸癌組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像；d圖為Stathmin蛋白在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像；e圖為Cathepsin B蛋白在高分化結(jié)直腸癌組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像；f圖為 Cathepsin B蛋白在中分化結(jié)直腸癌組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像；g圖為Cathepsin B蛋白在低分化結(jié)直腸癌組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像；h圖為Cathepsin B蛋白在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達的免疫組織化學(xué)染色圖像

注：a圖為Stathmin蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達情況柱狀圖；b圖為Stathmin蛋白在轉(zhuǎn)移灶組織中表達情況柱狀圖；**為P<0.01,*為P<0.05

注：a圖為Cathepsin B蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達情況柱狀圖；b圖為Cathepsin B蛋白在轉(zhuǎn)移灶組織中表達情況柱狀圖；***為P<0.001)

本文免疫組化染色結(jié)果顯示低分化結(jié)直腸癌腫瘤細胞核Stathmin蛋白陽性表達，表明Stathmin蛋白入核與腫瘤的惡性程度的升高密切相關(guān)，但Stathmin蛋白入核的具體分子生物學(xué)機制仍需進一步研究證實。Stathmin磷酸化和去磷酸化作用在細胞周期G2-M期發(fā)揮重要作用，活性形式的Stathmin需同時具備3個或4個磷酸化位點的激活，從而介導(dǎo)細胞周期的順利進行。目前較多的學(xué)者認為，Stathmin的表達受到許多細胞因子的負性調(diào)節(jié)，如P53等。野生型的P53可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制Stathmin蛋白的表達[19]，從而抑制細胞有絲分裂和細胞增殖活性，而突變型的P53對Stathmin的負性調(diào)控作用被解除，引起Stathmin蛋白的表達上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤形成。由于P53基因的突變或缺失與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，尤其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程的關(guān)系更為密切[20]，本研究利用IHC對結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞中Stathmin蛋白的染色結(jié)果表明，Stathmin蛋白的表達上調(diào)可能與腫瘤細胞中突變型P53蛋白的表達上調(diào)有關(guān)。

組織蛋白酶(Cathepsin)是位于溶酶體內(nèi)的一種半胱氨酸蛋白酶超家族，其主要生物學(xué)活性是參與生物體內(nèi)某些前體蛋白的修飾。Cathepsin B是該蛋白酶超家族的重要成員之一，是由二硫鍵連接一條重鏈和一條輕鏈組成的分子量為29KD的二聚體，其重要的生物學(xué)功能之一是作為淀粉樣前體蛋白分泌酶參與淀粉樣前體蛋白的分解加工，這種淀粉樣蛋白的活性與阿爾茨海默病的發(fā)生具有密切關(guān)系[9-10]，相關(guān)研究結(jié)果表明通過調(diào)控Cathepsin B蛋白的表達可以明顯提高阿爾茨海默病患者的精神狀態(tài)與記憶能力。近期Alapati等[21]研究表明Cathepsin B與UPAR協(xié)同調(diào)節(jié)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細胞的遷移活性，Cathepsin B 通過作用于JNK-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中磷酸化的JNK以及MEKK1等蛋白的活性而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細胞的遷移活性，與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Ma等[22]通過免疫組化染色及熒光轉(zhuǎn)染等方式對食管正常黏膜組織，食管癌前病變黏膜組織及食管鱗狀細胞癌組織等的比較，揭示了Cathepsin B蛋白在正常食管黏膜組織中表達缺失，但是在食管癌前病變組織及食管鱗狀細胞癌組織中Cathepsin B蛋白的表達均上調(diào)；與對照組相比，將轉(zhuǎn)染Cathepsin B的正常食管上皮細胞接種入裸鼠體內(nèi)引起食管鱗狀細胞癌的發(fā)生，證實了Cathepsin B活性與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文中不同分化程度的結(jié)直腸癌組織中Cathepsin B蛋白的表達均上調(diào)，并且在轉(zhuǎn)移灶組織中的表達較高，與上述研究趨勢一致。

目前關(guān)于Cathepsin B入核的分子生物學(xué)機制了解較少，有學(xué)者認為在腫瘤細胞發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中，溶酶體內(nèi)Cathepsin B的活性上調(diào)可以很好的為腫瘤細胞的前進清理道路，使腫瘤細胞更好的運動并且轉(zhuǎn)移到合適的場所。大量研究結(jié)果均表明Cathepsin B轉(zhuǎn)染后可以上調(diào)乳腺癌細胞，胰腺癌細胞，淋巴瘤細胞等的增殖活性以及侵襲轉(zhuǎn)移能力；接種Cathepsin B陽性表達的腫瘤細胞更容易在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，表明Cathepsin B在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，可能與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，這與本文的研究結(jié)果相符，在低分化的結(jié)直腸癌組織中Cathepsin B蛋白在腫瘤細胞核表達上調(diào)，但是在高分化及中分化結(jié)直腸癌組織中其陽性表達部位在腫瘤細胞膜或細胞漿。因此，Cathepsin B可能作為判斷腫瘤患者臨床分級與分期并指導(dǎo)患者預(yù)后評估的可靠蛋白。結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶中Stathmin和Cathepsin B蛋白表達均上調(diào)，其表達情況與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切，可能是監(jiān)測腫瘤臨床組織學(xué)分級的有用指標。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics.CA，2011，61(2)：69-90.

[2] Mistry SJ,Atweh GF.Role of stathmin in the regulation of the mitotic spindle：potential applications in cancer therapy.The Mount Sinai journal of medicine,2002,69(5)：299-304.

[3] Alli E,Yang JM,Hait WN.Silencing of stathmin induces tumor-suppressor function in breast cancer cell lines harboring mutant p53.Oncogene，2007,26(7)：1003-1012.

[4] Zheng P,Liu YX,Chen L,et al.Stathmin,a new target of PRL-3 identified by proteomic methods,plays a key role in progression and metastasis of colorectal cancer.Journal of proteome research,2010,9(10)：4897-4905.

[5] Byrne FL,Yang L,Phillips PA,et al.RNAi-mediated stathmin suppression reduces lung metastasis in an orthotopic neuroblastoma mouse model.Oncogene,2014,33(7)：882-890.

[6] Zhang CY,Xiao ZA,Zeng YC,et al.Expression of stathmin mRNA and protein in laryngeal squamous cell carcinoma and its clinical implication.Zhonghua er bi yan hou tou jing wai ke za zhi,2008,43(4)：291-295.

[7] Sadow PM,Rumilla KM,Erickson LA,et al.Stathmin expression in pheochromocytomas,paragangliomas,and in other endocrine tumors.Endocrine pathology,2008,19(2)：97-103.

[8] Wei SH,Lin F,Wang X,et al.Prognostic significance of stathmin expression in correlation with metastasis and clinicopathological characteristics in human ovarian carcinoma.Acta histochemica,2008,110(1)：59-65.

[9] Wang C,Sun B,Zhou Y,et al.Cathepsin B degrades amyloid-beta in mice expressing wild-type human amyloid precursor protein.The Journal of biological chemistry,2012,287(47)：39834-39841.

[10] Kindy MS,Yu J,Zhu H,et al.Deletion of the cathepsin B gene improves memory deficits in a transgenic ALZHeimer's disease mouse model expressing Abetapp containing the wild-type beta-secretase site sequence.JAD,2012,29(4)：827-840.

[11] Rafn B,Nielsen CF,Andersen SH,et al.ErbB2-driven breast cancer cell invasion depends on a complex signaling network activating myeloid zinc finger-1-dependent cathepsin B expression.Molecular cell,2012,45(6)：764-776.

[12] Andl CD,McCowan KM,Allison GL,et al.Cathepsin B is the driving force of esophageal cell invasion in a fibroblast-dependent manner.Neoplasia,2010,12(6)：485-498.

[13] Bao W,Fan Q,Luo X,et al.Silencing of Cathepsin B suppresses the proliferation and invasion of endometrial cancer.Oncology reports,2013,30(2)：723-730.

[14] Chan AT,Baba Y,Shima K,et al.Cathepsin B expression and survival in colon cancer：implications for molecular detection of neoplasia.Cancer epidemiology,biomarkers & prevention：a publication of the american association for cancer research,cosponsored.The american society of preventive oncology,2010,19(11)：2777-2785.

[15] Sun B,Zhang S,Zhang D,et al.Identification of metastasis-related proteins and their clinical relevance to triple-negative human breast cancer.Clinical cancer research,2008,14(21)：7050-7059.

[16] Sellin ME,Holmfeldt P,Stenmark S,et al.Global regulation of the interphase microtubule system by abundantly expressed Op18/stathmin.Molecular biology of the cell,2008,19(7)：2897-2906.

[17] Yuan RH,Jeng YM,Chen HL,et al.Stathmin overexpression cooperates with p53 mutation and osteopontin overexpression,and is associated with tumour progression,early recurrence,and poor prognosis in hepatocellular carcinoma.The Journal of pathology,2006,209(4)：549-558.

[18] Belletti B,Nicoloso MS,Schiappacassi M,et al.Stathmin activity influences sarcoma cell shape,motility,and metastatic potential.Molecular biology of the cell,2008,19(5)：2003-2013.

[19] Singer S,Malz M,Herpel E,et al.Coordinated expression of stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer.Cancer research,2009,69(6)：2234-2243.

[20] Carney BK,Cassimeris L.Stathmin/oncoprotein 18,a microtubule regulatory protein,is required for survival of both normal and cancer cell lines lacking the tumor suppressor,p53.Cancer biology & therapy,2010,9(9)：699-709.

[21] Alapati K,Kesanakurti D,Rao JS,et al.UPAR and cathepsin B-mediated compartmentalization of JNK regulates the migration of glioma-initiating cells.Stem cell research,2014,12(3)：716-729.

[22] Ma W,Ma L,Zhe H,et al.Detection of esophageal squamous cell carcinoma by cathepsin B activity in nude mice.PloS one,2014,9(3)：92351.