Aβ在兩種阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦杏仁核分布的比較研究

周 奕,鄧志偉,艾衛(wèi)敏,朱耀峰,張劍峰,盧 璨,雷德亮

(1.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)科部，中國 長沙 410100；2.湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，中國 湘潭 411012；3.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，中國 吉首 416000；4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410013；5.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410013)

Aβ在兩種阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦杏仁核分布的比較研究

周 奕1,鄧志偉1,艾衛(wèi)敏2,朱耀峰3,張劍峰4,盧 璨4,雷德亮5*

(1.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)科部，中國 長沙 410100；2.湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，中國 湘潭 411012；3.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，中國 吉首 416000；4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410013；5.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，中國 長沙 410013)

目的：比較研究Aβ在兩種AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦杏仁核分布的差異．方法:采用18月齡雄性APP/PSl雙轉(zhuǎn)基因(2×Tg-AD) 小鼠與同齡同性別APP/PSl/tau三轉(zhuǎn)基因(3×Tg-AD)小鼠，分別進(jìn)行6E10單克隆抗體免疫組化染色等方法顯示Aβ陽性神經(jīng)元及斑塊，觀察其分布與形態(tài)等的差異，圖像分析系統(tǒng)定量比較其量的變化．結(jié)果：在杏仁核2×Tg-AD組Aβ陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞外成為細(xì)胞外Aβ(eAβ)，形成大量的Aβ陽性斑，Aβ陽性神經(jīng)元少；而3×Tg-AD組 Aβ陽性產(chǎn)物主要位于神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，成為細(xì)胞內(nèi)Aβ(iAβ),但Aβ陽性斑少見．結(jié)論：2×Tg-AD組與3×Tg-AD組 Aβ陽性產(chǎn)物在杏仁核分布的差異可能反映了兩種AD小鼠模型神經(jīng)病理等改變的不同．

阿爾茨海默?。晦D(zhuǎn)基因小鼠；β淀粉樣蛋白；杏仁核

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 臨床上表現(xiàn)為：起病隱襲、進(jìn)行性發(fā)展的記憶、言語、視空間、認(rèn)知功能減退及人格的異常等[1-2]．其主要病變?yōu)椋篈β異常聚集和沉積形成老年斑(senile plaques，SPs)；顳葉、海馬、杏仁核等部位神經(jīng)元及突觸丟失；tau異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)和顆?？张葑冃?granulovacuolar degeneration，GD)等[3-5]．

AD的病因及發(fā)病機制復(fù)雜，有多種學(xué)說，至今仍未闡明．Aβ學(xué)說是目前普遍認(rèn)同的AD主要發(fā)病機制之一：Aβ在腦內(nèi)異常聚集并纖維化形成SPs，其神經(jīng)毒性作用可破壞鈣離子平衡、誘發(fā)氧化應(yīng)激、激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、激活凋亡相關(guān)蛋白等啟動凋亡程序并導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元丟失，進(jìn)而形成認(rèn)知功能損害，出現(xiàn)相應(yīng)的癡呆癥狀[6-8]．用于AD研究的動物模型有很多種，且各具特點．其中過度表達(dá)人類家族性突變的APP基因和PS1基因的 2×Tg-AD 小鼠，以及過度表達(dá)APP、PS1和tau基因的 3×Tg-AD 小鼠均能模擬出AD的某些神經(jīng)生物學(xué)特征性改變，然而針對這兩種動物模型腦內(nèi)重要區(qū)域Aβ分布的比較還未見報道．本研究通過Aβ單克隆抗體(6E10)免疫組化染色結(jié)合形態(tài)學(xué)分析等方法，比較18月齡 2×Tg-AD 與 3×Tg-AD 小鼠杏仁核中Aβ分布的差異，探討兩種AD小鼠模型病理形態(tài)等的不同．

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18月齡健康雄性2×Tg-AD小鼠8 只，含有突變的APPSwe/PS1△E9，由北京利昊生物科技有限公司提供．同齡雄性3×Tg-AD小鼠 8 只，含突變的APPSwe/PS1M146V/tauP301L，由美國國立衛(wèi)生研究院Ingram博士資助．實驗動物在SPF(Specific pathogen Free)級環(huán)境下飼養(yǎng)，嚴(yán)格控制溫度、濕度、光照、換氣條件等．高壓滅菌的普通膳食喂養(yǎng)，定時稱體質(zhì)量，了解小鼠生長發(fā)育情況．

1.2 實驗方法

1.2.1 組織制備 小鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的水合氯醛按10 μL/g腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實驗臺上．于上腹部剪開腹壁，向上緊貼劍突左側(cè)剪破胸壁與膈肌，暴露心臟．在心尖剪一小口，迅速將灌注針經(jīng)心尖送至升主動脈根部，隨后剪開右心耳，可見血液快速流出．先用20～30 ℃ 0.9%的氯化鈉溶液 20～30 mL快灌，可見肝臟顏色迅速變白，再用4 ℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液(Paraformaldehyde，PFA)(0.1 mol/L, pH=7.4)50～100 mL灌注，前1/3快灌，后2/3慢灌，使PFA充分滲透，維持30～40 min．灌注過程中可見小鼠尾巴抖動，四肢顫抖，并逐漸變硬．灌注完成后取腦，在4 ℃的 4%PFA中固定12 h，然后沉于30%的蔗糖溶液4 h．在 -20 ℃條件下作連續(xù)冠狀切片，片厚 30 μm，收集杏仁核層面切片，待用．

1.2.2 免疫組化 Aβ單克隆抗體(6E10)進(jìn)行ABC法免疫組織化學(xué)染色，主要過程如下：80%的甲酸修復(fù)抗原30 min；1%H2O215 min去除內(nèi)源性過氧化酶干擾；0.5%Triton X-100 15 min以增加細(xì)胞膜通透性；5%的正常山羊血清封閉1 h；小鼠抗人6E10 單克隆抗體(1∶400)置4 ℃搖床12 h；生物素化山羊抗鼠IgG(1∶200)，室溫?fù)u床2 h；親和素-生物素化酶(ABC)復(fù)合物(1∶150)，室溫?fù)u床上孵育 1.5 h；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5 min，鏡下觀察并控制染色的強度．以上各步驟之間均用0.01 mol/L PBS漂洗 3 次，每次 5 min；明膠玻片貼片；自然干燥后，0.1%尼氏染液復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯脫脂，明膠封片．

陰性對照：用0.01 mol/L PBS代替一抗，排除二抗的非特異性染色，結(jié)果為陰性．

1.3 數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計學(xué)處理

Motic-K400L顯微鏡在高倍視野(×60)下使用IPP軟件計數(shù)杏仁核的相似視野中能夠分清細(xì)胞輪廓的陽性細(xì)胞數(shù)，并取其均值．染色深度達(dá)到足以區(qū)分細(xì)胞周界的神經(jīng)元被計數(shù)，全部計數(shù)均由一人采用盲法操作完成．每只小鼠腦組織檢測3張切片，每張切片檢測 3個視野．

HPIAS-1000H高清晰度彩色圖像檢測系統(tǒng)測定杏仁核區(qū)陽性表達(dá)產(chǎn)物的平均灰度值，同時測量各切片背景灰度值．免疫陽性灰度值=背景灰度值-免疫陽性產(chǎn)物平均灰度值．實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示．樣本均數(shù)的比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析并用SPSS V20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理．P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 Aβ陽性神經(jīng)元 Aβ陽性神經(jīng)元輪廓較清晰，細(xì)胞胞體較大呈圓形，胞漿中可見灰褐色的免疫陽性產(chǎn)物(即細(xì)胞內(nèi)Aβ)．2×Tg-AD 組Aβ陽性的神經(jīng)元數(shù)量極少，呈稀疏無規(guī)則散在分布；3×Tg-AD組可見大量密集分布的Aβ陽性神經(jīng)元，且杏仁核中心區(qū)相對數(shù)目較多(Fig.1 A-D)．

2.1.2 Aβ陽性斑塊 2×Tg-AD、3×Tg-AD小鼠腦內(nèi)均可見Aβ陽性的黑褐色斑塊(即老年斑SPs)．2×Tg-AD組Aβ陽性斑塊染色較深呈散在分布，數(shù)量多、面積大；3×Tg-AD組斑塊染色較淡，僅在杏仁核中心區(qū)呈點狀分布(Fig.1 A-D)．

2.2 定量分析

2.2.1 Aβ陽性神經(jīng)元 杏仁核2×Tg-AD組Aβ陽性細(xì)胞計數(shù)(個/視野)12±3.42與3×Tg-AD組Aβ陽性細(xì)胞計數(shù)28±6.38比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)．2×Tg-AD組Aβ陽性細(xì)胞平均灰度值(MOD)179.12±3.98與3×Tg-AD組Aβ陽性細(xì)胞平均灰度值104.21±5.63比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)．

2.2.2 Aβ陽性斑塊 杏仁核2×Tg-AD組Aβ斑占總面積(2.8±0.47)%；3×Tg-AD組Aβ斑占總面積(1.1±0.65)%.二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)．

表1 Aβ陽性神經(jīng)元數(shù)、平均灰度值及Aβ斑在兩種動物杏仁核的比較(*，P<0.05)

圖1 6E10免疫陽性產(chǎn)物在杏仁核的分布A、B為2×Tg-AD組，C、D為3×Tg-AD組．圖B、D (標(biāo)尺=20 μm)取自于圖A、C (標(biāo)尺=100 μm) Fig.1 The distribution of 6E10 immunoreactive products in the amygdaleA and B for 2×Tg-AD, C and D for 3×Tg-AD. B and D (scale bar =20 μm) were taken from A and C (scale bar =100 μm)

3 討論

本研究觀察到2×Tg-AD組杏仁核可見大量6E10免疫陽性斑，這與其他研究者的報道是一致的[9-11]．說明在這類轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中，細(xì)胞外Aβ(extracelluarβ-amyloid ，eAβ)的沉積是其主要的病變．eAβ在AD病理過程中的作用有較多研究報道，主要表現(xiàn)在以下幾方面：(1)eAβ可誘發(fā)腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)．eAβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和補體系統(tǒng)，釋放促炎因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變[12]．人們在AD患者腦中發(fā)現(xiàn)，在SPs的核心周圍可見聚集的小膠質(zhì)細(xì)胞并與SPs相互交錯，小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活同AD的神經(jīng)病理改變有一定的聯(lián)系，據(jù)此推測eAβ可能是通過免疫炎癥反應(yīng)促進(jìn)AD的發(fā)生．臨床流行病學(xué)調(diào)查表明，長期服用抗炎藥物后AD發(fā)病率減低，并對認(rèn)知功能具有保護(hù)作用．(2)Nelson 等發(fā)現(xiàn)eAβ可使某些抗氧化酶活性降低從而導(dǎo)致氧自由基的濃度異常升高，其可能是誘發(fā)AD的機理之一[13]．eAβ也可通過其它多種途徑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)過氧化物、脂質(zhì)過氧化物大量產(chǎn)生．這些產(chǎn)物的增加可導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)能障礙，最終啟動細(xì)胞的凋亡過程．(3)異常增加的eAβ的作用曾經(jīng)被認(rèn)為還通過多種方式尤其是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的途徑，從而引起神經(jīng)元退行性變．支持該觀點的依據(jù)有：與早期家族性AD相關(guān)的PS1、PS2、APP基因突變可使eAβ含量增加；Aβ降解酶基因的多態(tài)性，其中包括編碼人胰島素降解酶的基因，可能導(dǎo)致AD的發(fā)生；實驗動物治療研究發(fā)現(xiàn)抗-Aβ治療有一定療效．因此，清除eAβ及eAβ神經(jīng)毒性，曾經(jīng)是AD治療的主要研究方向．然而，Aβ免疫實驗僅起到輕微延緩AD進(jìn)程的作用并出現(xiàn)了無菌性腦炎的嚴(yán)重副作用而被迫中斷[14-16]．近年來，人們通過對AD轉(zhuǎn)基因小鼠及AD病人的腦組織的研究，發(fā)現(xiàn)存在細(xì)胞內(nèi)Aβ，并對AD病理的發(fā)展起重要作用．

作者在對3×Tg-AD組的研究中發(fā)現(xiàn)，eAβ陽性斑塊小且少，而神經(jīng)元內(nèi)有很多6E10陽性產(chǎn)物即細(xì)胞內(nèi)Aβ(intracelluarβ-amyloid ，iAβ)，這種現(xiàn)象還少見報道．近年來，神經(jīng)元iAβ的存在與作用越來越受到人們的重視，其在AD中的作用也是多方面的：(1)iAβ可影響突觸功能[17]．Meng等通過尸體解剖發(fā)現(xiàn)在AD的早期即出現(xiàn)明顯的突觸可塑性的改變[18]．Gimenez等發(fā)現(xiàn)3×Tg-AD轉(zhuǎn)基因小鼠1到4個月時，皮質(zhì)、杏仁核等部位的突觸間傳遞喪失了近40%，而通過免疫組化等方式僅能檢測到iAβ[19]．提示：AD早期在無細(xì)胞外斑塊形成的情況下iAβ積聚，導(dǎo)致突觸的損害．這可以解釋老年斑形成和認(rèn)知障礙之間的不一致性．(2)iAβ可導(dǎo)致線粒體受損[20]．線粒體通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生能量物質(zhì)ATP，同時參與維持正常的細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡．此外，線粒體在控制細(xì)胞凋亡中擔(dān)當(dāng)重要角色．線粒體的功能障礙會導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過度和細(xì)胞色素C的釋放，并將促使凋亡肽酶激活因子與細(xì)胞凋亡蛋白酶9-前原蛋白結(jié)合，啟動凋亡過程．(3)ZHANG等通過對原代培養(yǎng)的人類神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)顯微注射Aβ可出現(xiàn)P53和Bax蛋白介導(dǎo)的選擇性殺傷作用[21-22]．(4)iAβ多肽與細(xì)胞內(nèi)載脂蛋白E的聚集密切相關(guān)，而后者與DNA斷裂和細(xì)胞溶解有緊密聯(lián)系．(5)iAβ還可通過減低特異的蛋白磷酸酶活性和(或)增強糖原合成酶活性誘導(dǎo)tau蛋白的異常磷酸化，從而損傷神經(jīng)元．此外，在自然衰老的恒河猴腦中，Aβ同樣被發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，早于淀粉樣斑塊的形成；同時證明Aβ寡聚體可以引發(fā)神經(jīng)元退行性變[23]．

杏仁核(amygdale)是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，其具有調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動、處理情感反應(yīng)及記憶等功能[24-25]．Horínek等通過MRI研究發(fā)現(xiàn)在AD的早期診斷中杏仁核與海馬有著相同的診斷價值，并且認(rèn)為兩者在短期記憶過程中都擔(dān)當(dāng)著重要的角色；當(dāng)AD出現(xiàn)輕微的精神癥狀時，杏仁核普遍發(fā)生了早期的損害[24]．Hampel等研究表明杏仁核不僅是AD腦內(nèi)重要的病變部位之一，而且其Aβ異常沉積發(fā)生的時間可能比海馬、皮質(zhì)等區(qū)域更早[25]．上述研究表明杏仁核與AD有密切的關(guān)系．

作者比較了18月齡時2×Tg-AD與3×Tg-AD小鼠模型杏仁核Aβ分布特點．結(jié)果發(fā)現(xiàn)：2×Tg-AD組Aβ沉積主要發(fā)生在細(xì)胞外，3×Tg-AD組Aβ沉積主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)．在其他腦區(qū)也存在類似的表達(dá)差異．造成這種差異的原因目前還不清楚，有待深入研究．Aβ與AD的神經(jīng)病理改變有著密切的關(guān)系，但Aβ如何引起神經(jīng)元退行性變，其最初的作用位點是在細(xì)胞外還是細(xì)胞內(nèi)，至今仍存在爭議．由于3×Tg-AD小鼠過度表達(dá)的tau基因可能影響Aβ聚集的部位，并且3×Tg-AD小鼠早期即有明顯的神經(jīng)元死亡、突觸丟失及學(xué)習(xí)記憶行為的改變[26]，據(jù)此作者推測iAβ的神經(jīng)毒性可能在神經(jīng)元退行性改變并導(dǎo)致AD發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用．

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(編輯 王 健)

Comparative Study on the Distribution of Aβin Amygdale of Two Transgenic Mice Models of Alzheimer’s Disease

ZHOUYi1,DENGZhi-wei1,AIWei-min2,ZHUYao-feng3,ZHANGJian-feng4,LUCan4,LEIDe-liang5*

(1.Basic Medical Department, Changsha Health Vocational College, Changsha 410100, China;2.School of Nursing, Xiangtan Vocational and Technical College, Xiangtan 411012, China;3.Medicine School of Jishou University, Jishou 416000, China;4.Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, China；5.Basic School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, China)

Objective:To compare the distribution and morphological features of Aβimmunoreactive products in the amygdale of two transgenic mice models of Alzheimer’s disease. Methods: 18-month-old APP/PSl(2×Tg-AD) and the age-matched male mice of APP/PSl/tau(3×Tg-AD) were used in this experiment. 6E10 immunohistochemical staining was used to show the distribution and morphological features of Aβimmunoreactive products，and quantitative analysis were made on the difference of the products by an image analysis system. Results:The deposition of Aβin the amygdala of 2×Tg-AD was mainly seen as extracellular Aβ(eAβ), and formed a lot of positive plaques; the positive products were distributed as intracellularly Aβ(iAβ) for the 3×Tg-AD, but the Aβpositive plaques were rarely seen. Conclusion:The difference of Aβpositive products distribution between the 2×Tg-AD and 3×Tg-AD is likely to be related to the difference of neuropathological changes of these two AD models.

AD; transgenic mice; Aβ; amygdale

2014-05-08

湖南省衛(wèi)生廳科研基金課題資助項目(B2014-151)；湖南省教育廳科學(xué)研究資助項目(14C0091)；米塔爾學(xué)生創(chuàng)新資助項目(10MX19);長沙市2013年度指導(dǎo)性科技計劃資助項目(K13ZD046-33)

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R749.16

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1000-2537(2014)05-0026-05