射干麻黃湯加味對哮喘小鼠肺組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)的影響※

張 麗 趙 輝 季 輝 孫義田

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肺病科，河北 滄州 061001)

實(shí)驗(yàn)研究

射干麻黃湯加味對哮喘小鼠肺組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)的影響※

張 麗 趙 輝 季 輝 孫義田

(河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肺病科，河北 滄州 061001)

目的探討射干麻黃湯加味對慢性哮喘小鼠肺組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)表達(dá)的影響。方法將50只健康清潔級雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、地塞米松組、射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組，每組各10只。建立慢性哮喘小鼠模型后，各藥物組分別予相應(yīng)藥物干預(yù)，正常對照組及模型組予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。連續(xù)4周后取各組小鼠肺組織，采用免疫組織化學(xué)染色(SP法)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測小鼠肺組織內(nèi)PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果與正常對照組比較，模型組小鼠的PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加(P<0.05)，經(jīng)地塞米松組處理后PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)有所降低(P<0.05)，而射干麻黃湯及射干麻黃湯加味組均有所增加(P<0.05)，射干麻黃湯加味組尤為明顯(P<0.05)。結(jié)論射干麻黃湯加味可抑制BALB/c哮喘小鼠哮喘的發(fā)生，其機(jī)制有可能是通過升高PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

哮喘；疾病模型，動(dòng)物；動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)；小鼠；射干麻黃湯；介子；地龍；過氧化物酶體增殖物激活受體

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPAR-γ)是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員。該受體活化后可以調(diào)控多種核內(nèi)靶基因表達(dá)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，特別是與哮喘患者氣道炎癥反應(yīng)存在密切關(guān)聯(lián)[1]。射干麻黃湯是傳統(tǒng)中醫(yī)治療哮喘的常用方劑，我們通過臨床反復(fù)對比、優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯加味治療哮喘具有更加明顯的療效。本研究的目的在于探討射干麻黃湯加味對于慢性哮喘小鼠肺組織PPAR-γ表達(dá)的影響，從而在分子水平探討其防治哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠50 只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK(黑)-2006009，飼養(yǎng)溫度25.0～26.0 ℃，相對濕度60%～70%，晝夜明暗交替各12 h。

1.1.2 藥物與試劑 射干麻黃湯(藥物組成：射干15 g，麻黃9 g，生姜9 g，半夏9 g，紫菀6 g，款冬花6 g，五味子3 g，細(xì)辛3 g，大棗6 g)，生藥由我院中藥房提供，用蒸餾水1 000 mL先煎麻黃5 min后入余藥，共水煎2次，然后過濾，濃縮為100 mL，每mL含生藥0.66 g。射干麻黃湯加味為射干麻黃湯加芥子9 g、地龍6 g，生藥由我院中藥房提供，用蒸餾水1 000 mL先煎麻黃5 min后入余藥，共水煎2次，然后過濾，濃縮為100 mL，每mL含生藥0.81 g。腹腔致敏液(主要成分為卵蛋白10 μg及氫氧化鋁20 μg，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀氨基酸有限公司，國藥準(zhǔn)字H12020515)；PPAR-γ一抗(美國Santa Cruz公司)；SP免疫組化試劑盒(武漢博士生物工程德公司)；RT-PCR試劑盒(武漢博士生物工程德公司)；瓊脂糖(哈爾濱晶美生物技術(shù)公司)；Trizol試劑盒(美國Invitrogen Corp公司)。

1.1.3 主要儀器 霧化吸入器(PW.1型，上海醫(yī)療器械廠有限公司)，自制玻璃霧化箱(50 cm×40 cm×25 cm)，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀(Model550型，美國BIO-RAD公司)，定量PCR儀(ABI 7500型，美國ABI公司)，凝膠電泳成像系統(tǒng)(Gene Genius，美國Syngene公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、地塞米松組、射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組，每組各10只。除正常對照組外，其余各組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、15 d分別腹腔注射致敏液0.2 mL，第22 d開始于霧化吸入25 g/L卵蛋白，每日1次，每次30 min，連續(xù)4周建立哮喘動(dòng)物模型。同時(shí)正常對照組予等容積0.9%氯化鈉注射液霧化吸入。

1.2.2 給藥方法 第22 d起，射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組小鼠在每次霧化吸入前 30 min分別予相應(yīng)藥液0.5 mL灌胃；地塞米松組予地塞米松注射液0.26 mL(含生藥為0.65 mg/kg)腹腔注射；正常對照組及模型組予0.26 mL 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續(xù)干預(yù)4周。

1.3 標(biāo)本采集 末次霧化吸入24 h后以10%水合氯醛溶液400 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉后，迅速開胸，暴露氣管、雙肺，結(jié)扎右總支氣管，于遠(yuǎn)端切下，右肺上葉放入10%中性甲醛溶液中，余放入液氮中保存。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 肺組織PPAR-γ表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)染色(SP法)，石蠟切片，脫蠟至水，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。微波抗原修復(fù)，然后按試劑盒說明書進(jìn)行。以磷酸緩沖鹽(PBS)代替一抗作為陰性對照。兔抗鼠PPAR-γ抗體工作濃度為1∶100。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色陽性結(jié)果呈棕黃色，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 肺組織PPAR-γmRNA表達(dá) 采用RT-PCR技術(shù)檢測，提取RNA；逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，引物設(shè)計(jì)與合成：PPAR-γ和gapdh序列由Genebank獲得，以Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成。

Gapdh：5'-ACCATAGTCCATGCCATCAC-3'

3'-TCCATCACCCTGTTGCTGTA-5'；

PPAR-γ：5'-GGTTGATTTTCTCAGCGTTTC-3'

3'-TCAATCGGATGGTTCTTCGA-5'。

依次加入正反引物各0.5 μL，cDNA產(chǎn)物1 μL，10×緩沖液2.5 μL，氯化鎂2 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，Taq酶0.5 μL (1U)，加無RNA酶水至總?cè)莘e為25 μL。震蕩混勻放入定量PCR儀中，設(shè)置循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃后延伸10 min，-20 ℃保存。將制好的1.5%瓊脂糖凝膠置于電泳槽中，注入Tris-乙酸電泳液(稍高于凝膠層)。cDNA產(chǎn)物和6×上樣緩沖液按5∶1混合后加入加樣孔中，另加DNA marker。接通電流恒壓電泳30 min。采用美國Gene Genius凝膠電泳成像系統(tǒng)測出目的基因和gapdh的表達(dá)強(qiáng)度，以同一標(biāo)本的gapdh的產(chǎn)物積分光密度校正各自的目的基因的積分光密度值，并按公式相對值=目的基因表達(dá)強(qiáng)度/gapdh表達(dá)強(qiáng)度計(jì)算出相對值。

2 結(jié) 果

各組小鼠肺組織PPAR-γ陽性細(xì)胞數(shù)及PPAR-γmRNA表達(dá)比較 見表1、圖1。

組 別nPPAR-γ陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2)PPAR-γmRNA表達(dá)正常對照組106．21±0．300．12±0．03模型組1010．30±0．66?0．39±0．02?地塞米松組107．32±0．46?△0．24±0．06?△射干麻黃湯組1011．95±0．40?△#0．39±0．03?△#射干麻黃湯加味組1012．57±0．45?△#○0．55±0．06?△#

與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05；與射干麻黃湯組比較，○P<0.05

圖1 各組小鼠肺組織PPAR-γmRNA表達(dá)

A為正常對照組，B為模型組，C為地塞米松組，D為射干麻黃湯組，E為射干麻黃湯加味組

由表1、圖1可見，與正常對照組比較，模型組、地塞米松組、射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組小鼠肺組織PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯減少(P<0.05)，射干麻黃湯組及射干麻黃湯加味組PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與射干麻黃湯組比較，射干麻黃湯加味組PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)明顯增加 (P<0.05)。

3 討 論

射干麻黃湯是治療冷哮的常用傳統(tǒng)方劑。研究證實(shí)，該方可減輕氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性[2]，并能延緩氣道重塑進(jìn)程[3]，無論對于一般的哮喘發(fā)作[4]還是咳嗽變異性哮喘[5]均具有較好的效果，為增加療效其臨床多靈活加減治療。我們通過臨床反復(fù)篩選優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，本研究中的射干麻黃湯加味效果頗佳。射干麻黃湯加味是在射干麻黃湯的基礎(chǔ)上加芥子、地龍而成。芥子性味辛，溫，入肺、胃經(jīng)，利氣豁痰，溫中散寒，通絡(luò)止痛，可治痰飲咳喘、胸脅脹滿疼痛、反胃嘔吐等。孫思邈載其“治咳嗽胸脅支滿，上氣多唾者，每日溫酒吞下七粒”?！夺t(yī)學(xué)入門》中言及“利胸膈痰，止翻胃吐食，痰嗽上氣”。地龍性寒，味咸，可清熱、止喘、通絡(luò)，歸肝、胃、肺、膀胱經(jīng)，功能清熱平肝、熄風(fēng)止痙、平喘、利尿、通絡(luò)除痹?，F(xiàn)代藥理研究表明，地龍?zhí)崛∫壕哂辛己玫亩绕酱饔肹6]。我們在治療冷哮的溫?zé)崴幬镏屑尤胄┝亢疀鏊幬?，即可防熱藥辛散太過，又可加強(qiáng)平喘之效。

PPAR-γ參與調(diào)控哮喘多種炎癥細(xì)胞的功能及炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，作用機(jī)制復(fù)雜[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察射干麻黃湯加味對慢性哮喘小鼠肺組織PPAR-γ表達(dá)的影響，探討其治療哮喘的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘組肺泡區(qū)有大量的PPAR-γ陽性細(xì)胞(P<0.05)，PPAR-γmRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯增加(P<0.05)。地塞米松能明顯下調(diào)肺組織PPAR-γ數(shù)量及PPAR-γmRNA表達(dá)(P<0.05)，但不能有效抑制氣道炎癥。而射干麻黃湯及其加味均可增強(qiáng)肺組織PPAR-γ陽性細(xì)胞數(shù)及PPAR-γmRNA的表達(dá)(P<0.05)。提示射干麻黃湯及其加味與地塞米松的作用機(jī)制不同。我們分析，哮喘時(shí)PPAR-γ的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄是對氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)的應(yīng)答，目的在于阻止炎性細(xì)胞的激活，在使用射干麻黃湯及其加味后PPAR-γ的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，從而調(diào)動(dòng)了其阻止炎性細(xì)胞激活功能，最終也達(dá)到了抑制氣道炎癥的抗炎效果。

綜上所述，射干麻黃湯加味可抑制BALB/c哮喘小鼠哮喘的發(fā)生，其機(jī)制有可能是通過升高PPAR-γ的數(shù)量及轉(zhuǎn)錄表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，射干麻黃湯加味對PPAR-γ的數(shù)量、轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響大于射干麻黃湯組，從側(cè)面也證實(shí)了中醫(yī)辨證論治理論的正確性。

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(本文編輯：曹志娟)

StudyofSheganMahuangdecoctionontheexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorγinlungtissueofAsthmaticmice

ZHANGLi,ZHAOHui,JIHui,etal.

PulmonaryDiseaseDepartment,CangzhouHospitalsofTraditionalChineseandWesternmedicine,Hebei,Cangzhou061001

ObjectiveTo explore the effect of Shegan Mahuang decoction on the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ) in lung tissue of Asthmatic mice.Methods50 healthy clean female BALB / c mice were randomly divided into normal control group, model group, Dexamethasone group, Shegan Mahuang decoction group and improved Shegan Mahuang decoction group, 10 mice in each group.After establishing a mouse model of chronic asthma, corresponding to each drug group were drug intervention, the normal control group and model group were 0.9% sodium chloride injection by intraperitoneal injection.After four consecutive weeks mice lung tissue of each group were taken, the number and the expression transcription of PPAR-γ in mouse lung tissue were detected using immunohistochemical staining (SP), RT-PCR technique.ResultsThe number and the expression transcription of PPAR-γ in mouse lung tissue in model group were increased as compared with those in normal control group (P<0.05).The number and the expression transcription of PPAR-γ were decreased after treatment of Dexamethasone (P<0.05).Those in Shegan Mahuang decoction group and improved Shegan Mahuang decoction group were increased (P<0.05).The increase in improved Shegan Mahuang decoction group was obvious (P<0.05).ConclusionShegan Mahuang decoction can inhibit incidence of asthma in BALB / c mice with asthma, the mechanism may be achieved by increasing the number of PPAR-γ expression and transcription.

Asthma; Disease models; Animal; Experiments; Mouse; Sheganmahuang decoction; Meson; Earthworm; Peroxisome proliferator-activated receptor

※ 項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局2011年度中醫(yī)藥類科研計(jì)劃課題(編號：2011161)

張麗(1981—)，女，主治醫(yī)師，博士。從事呼吸科臨床工作。研究方向：呼吸系統(tǒng)各種常見病、疑難病的中西醫(yī)結(jié)合綜合治療。

R562.250.5；R289.5；R285.5

A

1002-2619(2014)06-0895-03

2013-07-15)