急性髓系白血病患者骨髓WT1基因的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

萬鼎銘,邊志磊,劉延方,曹偉杰,張 媛,李 濤,何海燕,玄中乾

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科 新鄉(xiāng) 453100 3) 鄭州大學(xué)血液病研究所 鄭州 450052△男,1963年5月生,博士,教授,主任醫(yī)師,研究方向：血液病和造血干細(xì)胞移植的基礎(chǔ)和臨床，E-mail：wwddmm@vip.sina.com

急性髓系白血病患者骨髓WT1基因的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

萬鼎銘1)△,邊志磊1),劉延方1),曹偉杰1),張 媛2),李 濤1,3),何海燕1),玄中乾1)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科 新鄉(xiāng) 453100 3) 鄭州大學(xué)血液病研究所 鄭州 450052△男,1963年5月生,博士,教授,主任醫(yī)師,研究方向：血液病和造血干細(xì)胞移植的基礎(chǔ)和臨床，E-mail：wwddmm@vip.sina.com

急性髓系白血??；WT1基因；預(yù)后

目的：探討急性髓系白血病(AML)患者骨髓WT1基因的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測122例初診AML患者骨髓WT1基因的表達(dá)水平，并進(jìn)行初次誘導(dǎo)化療緩解率(CR1)及2 a無白血病生存率(LFS)和總生存率(OS)的分析。對照組為21例非白血病患者或造血干細(xì)胞移植健康供者。結(jié)果對照組骨髓WT1基因表達(dá)水平為0.007(0.002，0.080)；AML組為0.677(0.336，0.763)，明顯高于對照組(Z=2.620，P<0.001)。AML-M3患者WT1基因高表達(dá)組與低表達(dá)組CR1、2 a LFS和OS無差異。AML(非M3)患者WT1基因低表達(dá)組CR1為82．6%(38/46)，高表達(dá)組為52.3%(23/44)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.476,P=0.002)；兩組的總生存曲線和無白血病生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.410、4.698,P<0.05)，高表達(dá)組2 a OS(36.0%)和LFS(33.3%)均低于低表達(dá)組(57.7%和53.7%)。結(jié)論骨髓WT1基因表達(dá)水平是預(yù)測AML預(yù)后的有效監(jiān)測指標(biāo)。

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一類高度異質(zhì)性疾病，不同亞型甚至同一亞型仍可能有不同的長期預(yù)后[1]。如何準(zhǔn)確地作出預(yù)后分層，進(jìn)而提供更加具有針對性和個體化的治療方案，從而提高整體長期生存率，是AML治療中最熱門也是最棘手的問題之一。實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RQ-RT-PCR)是應(yīng)用熒光探針結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄PCR方法動態(tài)監(jiān)測封閉試管內(nèi)mRNA水平變化，與流式細(xì)胞術(shù)相比，具有更高的敏感性和特異性。該方法用于特定融合基因或突變基因的檢測已相當(dāng)成熟，廣泛應(yīng)用于AML的預(yù)后分層及復(fù)發(fā)預(yù)測[2-3]。然而大部分AML患者并不存在特異的遺傳學(xué)或分子學(xué)標(biāo)記，因此需要尋找新的泛白血病監(jiān)測指標(biāo)。WT1基因的過表達(dá)存在于多種惡性血液疾病，已成為監(jiān)測AML微小殘留病灶的敏感指標(biāo)[4-7]，但WT1基因與AML長期預(yù)后的關(guān)系還存在爭議[8-9]。作者通過監(jiān)測初診AML患者骨髓WT1基因表達(dá)水平，并分析其與初次誘導(dǎo)化療緩解率(the complete remission rate after the first induction chemotherapy,CR1)及2 a無白血病生存率(leukemia-free survival rate,LFS)和2 a總生存率(overall survival rate,OS)的關(guān)系，探討其在AML預(yù)后分層和復(fù)發(fā)預(yù)測中的意義。

1 對象與方法

1.1研究對象選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科2010年1月至2012年1月門診或住院收治的AML患者122例，男68例，女54例，年齡16～70歲，中位年齡54歲。白血病的診斷均經(jīng)臨床癥狀、血常規(guī)、骨髓細(xì)胞學(xué)及組織化學(xué)染色、免疫分型、染色體核型分析確診，部分患者行融合基因檢測，符合白血病形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子學(xué)(MICM)診斷標(biāo)準(zhǔn)。122例患者同時經(jīng)FAB分型，其中M0型3例，M1型5例，M2型53例，M3型32例， M4型14例， M5型15例?；颊呒凹覍倬饨邮芤?guī)范方案治療。對照組21例，為同期就診的非白血病(過敏性紫癜、缺鐵性貧血、免疫性血小板減少性紫癜、巨幼細(xì)胞性貧血)患者及造血干細(xì)胞移植健康供者。

1.2治療方案及療效標(biāo)準(zhǔn)AML-M3治療方法參照《急性早幼粒細(xì)胞白血病中國診療指南(2011年版)》[10]。AML(非M3)治療方法參照《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2011年版)》[11]，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)量“DA”或“IA”方案作為初治誘導(dǎo)緩解方案，其后根據(jù)預(yù)后分層制定相應(yīng)治療方案。根據(jù)1987年全國白血病化療討論會制定的白血病療效評價標(biāo)準(zhǔn)，以骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測幼稚細(xì)胞比例≥0.05，或存在且病理活檢證實髓外浸潤作為復(fù)發(fā)及未緩解標(biāo)準(zhǔn)。隨訪時間1～36個月，中位隨訪時間21個月。

1.3觀察指標(biāo)CR1：根據(jù)初次誘導(dǎo)化療后3周骨髓細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果，以骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)幼稚細(xì)胞<0.05且無髓外浸潤為化療緩解標(biāo)準(zhǔn)，計算化療緩解率。 2 a LFS：2 a觀察期內(nèi)無白血病復(fù)發(fā)生存的概率,以復(fù)發(fā)為終點事件。2 a OS：2 a觀察期內(nèi)的總生存率，以死亡為終點事件。

1.4WT1基因的檢測

1.4.1 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 無菌條件下常規(guī)抽取對照組及AML患者治療前骨髓1～2 mL，0.5 mol/L EDTA抗凝，用常規(guī)Trizol方法提取總RNA，紫外分光光度計定量，-80 ℃凍存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書操作。

1.4.2 引物和探針的設(shè)計、合成 引物及探針序列根據(jù)GenBank基因序列自行設(shè)計，由上海Invitrogen公司合成。WT1上游引物為5’-CAGGCTGCAATA AGAGATATTTTAAGCT-3’，下游為5’-GAAGTCA CACTGGTATGGTTTCTCA-3’，擴(kuò)增片段大小為120 bp；探針序列為5’-CTTACAGATGCACAGCAGGAAG CACACTG-3’，5’端標(biāo)記熒光發(fā)光基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。內(nèi)參ABL基因上游引物為5’-TG GAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’，下游為5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’；探針序列為5’-CCATTTTTGGTTTGGGTTCACACCATT-3’。

1.4.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 從K562細(xì)胞(由鄭州大學(xué)干細(xì)胞中心提供)中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，在PE9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s， 35個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠切割、回收并純化，連結(jié)到PUCm-T質(zhì)粒，克隆后測序，證明連接產(chǎn)物為WT1基因片段。重組質(zhì)粒體外克隆后混勻、紫外分光光度計定量，稀釋為104～106拷貝數(shù)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄖ苽鋬?nèi)參基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4.4 熒光定量PCR 總反應(yīng)體系20 μL：包括Premia Ex TaqTM 10 μL,上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，熒光探針0.8 μL，cDNA模版溶液2 μL，滅菌去離子水6.4 μL。反應(yīng)程序：第一步42 ℃ 30 min，第二步94 ℃ 5 min，第三步94 ℃ 45 s，第四步60 ℃ 80 s，重復(fù)第三步到第四步40個循環(huán)。每批實驗均設(shè)立陰性及陽性對照。以WT1與內(nèi)參ABL絕對拷貝數(shù)之比作為WT1基因的表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。WT1基因表達(dá)水平呈非正態(tài)分布，用中位數(shù)(下，上四分位數(shù))描述，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計算2 a LFS和2 a OS,并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1AML患者骨髓WT1基因的表達(dá)對照組骨髓WT1基因表達(dá)水平為0.007(0.002，0.080)；AML組為0.677(0.336，0.763)，明顯高于對照組(Z=2.620，P<0.001)。不同臨床特征AML患者骨髓WT1基因的表達(dá)水平見表1。

表1 不同臨床特征AML患者骨髓WT1基因的表達(dá)

2.2AML-M3患者WT1基因表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系32例AML-M3患者在觀察期內(nèi)，除4例初次誘導(dǎo)治療中出現(xiàn)顱內(nèi)出血死亡，余28例均初治誘導(dǎo)達(dá)完全緩解，且該28例在觀察期內(nèi)無復(fù)發(fā)及死亡發(fā)生。以WT1基因表達(dá)水平中位數(shù)0.853為界，<0.853為WT1低表達(dá)，≥0.853為高表達(dá)，則這28例患者在觀察期內(nèi)，WT1基因高表達(dá)組與低表達(dá)組CR1、2 a LFS和OS相同。

2.3AML(非M3)患者WT1基因表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系A(chǔ)ML(非M3)患者90例，以 WT1基因表達(dá)水平中位數(shù)0.583為界，<0.583為WT1基因低表達(dá)，≥0.583為高表達(dá)。低表達(dá)組CR1為82．6%(38/46)，高表達(dá)組為52.3%(23/44)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.476,P=0.002)。兩組的2 a總生存曲線和無白血病生存曲線(圖1)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.410,P=0.020；χ2=4.698,P=0.030)。高表達(dá)組2 a OS(36.0%)和LFS(33.3%)均低于低表達(dá)組(57.7%和53.7%)。

圖1 WT1基因高、低表達(dá)組的生存曲線

3 討論

WT1基因最早以抑癌基因被發(fā)現(xiàn)于腎母細(xì)胞瘤中，該基因位于11p13，編碼一種鋅指蛋白類的轉(zhuǎn)錄因子。AML中WT1基因異常過度表達(dá)已被國內(nèi)外多中心研究所證實[5-6]，這也是WT1基因作為AML預(yù)后分層和復(fù)發(fā)預(yù)測的分子學(xué)標(biāo)記的理論基礎(chǔ)。用WT1基因預(yù)測AML短期復(fù)發(fā)的靈敏性和特異性均優(yōu)于傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)方法[12]，但WT1基因與AML長期預(yù)后的關(guān)系還存在爭議[8-9]。此次研究通過比較AML患者骨髓WT1基因高表達(dá)組與低表達(dá)組間CR1、2 a LFS和OS的差異，探討該基因?qū)ML長期預(yù)后的預(yù)測作用。結(jié)果顯示,WT1基因高表達(dá)的AML(非M3)患者組CR1、2 a LFS和OS均低于WT1基因低表達(dá)組，這與國外Nomdedeu等[8]的研究結(jié)果一致，但與Miglino等[9]的研究結(jié)果相悖，可能與病例數(shù)、分層及治療方案的不同有關(guān)。同時作者還發(fā)現(xiàn)AML-M3患者骨髓WT1基因表達(dá)水平與患者的預(yù)后并沒有相關(guān)性，這可能與該亞型的靶向治療藥物全反式維甲酸和三氧化二砷的應(yīng)用有關(guān)[13]。靶向治療藥物出現(xiàn)后AML-M3患者的長期生存率明顯提高，因此成為在AML預(yù)后分層中相對獨立的一個亞型。目前WT1基因在AML中過表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)主要考慮有WT1基因啟動子去甲基化、GATA等轉(zhuǎn)錄因子的過度激活、WT1基因突變等[14-15]。WT1基因表達(dá)水平與AML-M3患者的預(yù)后沒有相關(guān)性這一結(jié)果也從一個側(cè)面證明WT1基因的高表達(dá)并不是該疾病發(fā)病的始動因素，可能是由于信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的改變影響了該基因的表達(dá)狀態(tài)，并進(jìn)一步影響了下游基因的表達(dá)。

此次回顧性研究觀察時間1～3 a，相信隨著樣本數(shù)量的增加及觀察時間的延長,WT1基因與AML患者預(yù)后的關(guān)系會更明確。雖尚不能完全了解AML患者WT1基因過度表達(dá)的具體機(jī)制，但該基因在AML預(yù)后分層、微小殘留病灶監(jiān)測甚至治療中的作用將會越來越重要。該研究中WT1基因高表達(dá)組及低表達(dá)組均采用標(biāo)準(zhǔn)預(yù)后分層及治療分案[10-11]，在下一步治療中如果采用加入WT1基因的預(yù)后分層系統(tǒng)，根據(jù)預(yù)后分層采取不同的治療分案，相信能獲得更好的長期生存率。另外與WT1基因相關(guān)的腫瘤疫苗[16]已在研制過程中，相信隨著研究的進(jìn)一步深入，以WT1基因作為治療靶點的基因工程藥物也會越來越多。

[1]Estey EH.Acute myeloid leukemia:2013 update on risk-stratification and management[J].Am J Hematol,2013,88(4):318

[2]Szanto A,Pap Z,Benedek I,et al.Monitoring M-BCR-ABL expression level in CML patients by RQ-PCR:experience of a single center[J].Rom J Morphol Embryol,2013,54(1):37

[3]Zapparoli GV,Jorissen RN,Hewitt CA,et al.Quantitative threefold allele-specific PCR (QuanTAS-PCR) for highly sensitive JAK2 V617F mutant allele detection[J].BMC Cancer,2013,13:206

[4]Zhao XS,Yan CH,Liu DH,et al.Combined use of WT1 and flow cytometry monitoring can promote sensitivity of predicting relapse after allogeneic HSCT without affecting specificity[J].Ann Hematol,2013,92(8):1111

[5]秦亞溱，阮國瑞，李金蘭，等.定量檢測WT1基因表達(dá)水平在急性髓系白血病微量殘留病監(jiān)測中的意義[J].中華血液學(xué)雜志,2005,26(11):649

[6]Yoon JH,Kim HJ,Shin SH,et al.Serial measurement of WT1 expression and decrement ratio until hematopoietic cell transplantation as a marker of residual disease in patients with cytogenetically normal acute myelogenous leukemia[J].Biol Blood Marrow Transplant,2013,19(6):958

[7]Kramarzova K,Boublikova L,Stary J,et al.Evaluation of WT1 expression in bone marrow vs peripheral blood samples of children with acute myeloid leukemia-impact on minimal residual disease detection[J].Leukemia,2013,27(5):1194

[8]Nomdedeu JF,Hoyos M,Carricondo M,et al.Bone marrow WT1 levels at diagnosis, post-induction and post-intensification in adult de novo AML[J].Leukemia,2013,27(11):2157

[9]Miglino M,Colombo N,Pica G,et al.WT1 overexpression at diagnosis may predict favorable outcome in patients with de novo non-M3 acute myeloid leukemia[J].Leuk Lymphoma,2011,52(10):1961

[10]中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會.急性早幼粒細(xì)胞白血病中國診療指南(2011年版)[J].中華血液學(xué)雜志,2011,32(12):885

[11]中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會.成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國診療指南(2011年版)[J].中華血液學(xué)雜志,2011,32(11):804

[12]Fang M,Storer B,Wood B,et al.Prognostic impact of discordant results from cytogenetics and flow cytometry in patients with acute myeloid leukemia undergoing hematopoietic cell transplantation[J].Cancer,2012,118(9):2411

[13]郭學(xué)軍，李鳳菊，林曉燕，等.急性早幼粒細(xì)胞白血病患者完全緩解后小劑量砷劑加全反式維甲酸治療18例[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2006,41(3):597

[14]Goodfellow SJ,Rebello MR,Toska E,et al.WT1 and its transcriptional cofactor BASP1 redirect the differentiation pathway of an established blood cell line[J].Biochem J,2011,435(1):113

[15]Subbiah V,Brown RE,Jiang Y,et al.Morphoproteomic profiling of the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway in desmoplastic small round cell tumor (EWS/WT1), Ewing’s sarcoma (EWS/FLI1) and Wilms’ tumor(WT1)[J].PLoS One,2013,8(7):e68985

[16]Sugiyama H.WT1-targeting cancer vaccine[J].Nihon Rinsho,2012,70(12):2105

(2013-10-11收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Prognostic value of WT1 expression in bone marrow for acute myeloid leukemia

WANDingming1)，BIANZhilei1)，LIUYanfang1)，CAOWeijie1)，ZHANGYuan2)，LITao1,3)，HEHaiyan1)，XUANZhongqian1)

1)DepartmentofHematology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

2)DepartmentofHematology，theFirstAffiliatedHospital，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453100

3)InstituteofHematology，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

acute myeloid leukemia；WT1 gene；prognosis

Aim: To investigate the relationship between WT1 gene expression level in bone marrow of acute myeloid leukemia (AML) patients and the prognosis. Methods: A total of 122 newly diagnosed AML patients were subjected to detect WT1 expression level in bone marrow by real time quantitative reverse transcription-PCR method,and the complete remission rate after the first induction chemotherapy(CR1), two-year leukemia-free survival rate(LFS) and two-year overall survival rate (OS) were calculated.A total of 21 cases of non-AML were the control.Results: The median expression level of WT1 in AML patients was 0.677(0.336,0.763), which was higher than that of control[0.007(0.002,0.080),Z=2.620,P<0.001]. With regard to AML-M3 patients,CR1, two-year LFS and OS of the patients with high expression level of WT1 was similar to those of the patients with low expression level of WT1.With regard to non AML-M3 patients, CR1 in the high WT1 expression group was 52.3%, lower than that of 82.6% in the low WT1 expression group(χ2=9.476,P=0.002);the two-year leukemia-free survival curve and overall survival curve of high WT1 expression patients differed from those of low WT1 expression patients(χ2=4.698,5.410,P<0.05),and two-year LFS and OS of high WT1 expression patients were 33.3% and 36.0%,lower than 53.7% and 57.7% of the low WT1 expression patients.Conclusion: WT1 expression level in bone marrow could be an useful prognosis marker for AML patients.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.027

R557.3