河南省腫瘤、慢性丙型肝炎、白癜風患者HLA-A2的分布*

王海楠，祁元明，高艷鋒,周哲駿，李志勤，杜軍波，李建斌，張 毅

1)鄭州大學生物工程系 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 4)焦作煤業(yè)集團中央醫(yī)院皮膚科 焦作454000 5)河南省紅十字血液中心 鄭州450053 6)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 7)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

河南省腫瘤、慢性丙型肝炎、白癜風患者HLA-A2的分布*

王海楠1,2)，祁元明1)#，高艷鋒1),周哲駿1,2)，李志勤3)，杜軍波4)，李建斌5)，張 毅1，2，6，7)#

1)鄭州大學生物工程系 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052 4)焦作煤業(yè)集團中央醫(yī)院皮膚科 焦作454000 5)河南省紅十字血液中心 鄭州450053 6)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 7)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

#通訊作者：祁元明，女，1957年1月生，博士，教授，研究方向：抗原肽和多肽疫苗, E-mail：qymzzu@126.com；張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫學、腫瘤干細胞和生物細胞治療，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

HLA-A2；腫瘤；免疫治療；慢性丙型肝炎；白癜風

目的：分析河南地區(qū)腫瘤、慢性丙型肝炎、白癜風患者HLA-A2的分布頻率。方法應用流式細胞術和聚合酶鏈反應/序列特異性引物(PCR-SSP)技術檢測分析了72例健康人(正常對照)和438例腫瘤患者、110例慢性丙型肝炎患者、97例白癜風患者外周血中HLA-A2抗原的分布頻率。結果腫瘤、慢性丙型肝炎、白癜風患者中HLA-A2抗原的分布頻率分別為49.1%、39.0%、47.4%，與正常對照組的48.6%比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.006,1.611,0.230,P均>0.05)。病例數(shù)超過50的肺癌(91例)、胃癌(56例)和食管癌(126例)患者中HLA-A2分布頻率分別為42.9%、57.1%和38.0%，與正常對照比較，差異亦無統(tǒng)計學意義(χ2=0.537,0.919,2.081,P均>0.05)。結論河南腫瘤、慢性丙型肝炎及白癜風患者HLA-A2的分布無特異性，因此HLA-A2限制性的生物細胞免疫治療具有廣泛的應用價值。

腫瘤生物治療主要包括細胞過繼免疫治療、細胞因子治療、免疫基因治療、腫瘤疫苗和單克隆抗體技術, 其單獨應用或與手術、放療、化療聯(lián)合應用均已經(jīng)取得了令人矚目的臨床效果[1]。腫瘤生物治療的主要免疫學機制之一是腫瘤抗原肽段通過HLA呈遞在腫瘤細胞表面被T淋巴細胞識別，然后誘發(fā)腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes， CTL)反應。 抗原肽段、HLA以及T淋巴細胞之間存在著特異性的相互作用，也就是限制性。 目前絕大多數(shù)臨床試驗中使用的腫瘤疫苗或過繼轉移T細胞的療法都是基于HLA-A2呈遞的腫瘤抗原肽段誘導的CTL反應[2-3]。作者探討了HLA-A2在河南地區(qū)不同人群中的分布，為HLA-A2限制性抗原在特異性生物細胞治療中的應用奠定基礎。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2011年7月至2012年7月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院接受治療的438例腫瘤患者(男198例，女240例，年齡55～73歲)、110例慢性丙型肝炎患者(男62例，女48例，年齡30～70歲)和97例白癜風患者(男51例，女46例，年齡50～70歲)。正常對照來自于同期在河南省紅十字血液中心獻血的獻血員，共72人，男38人，女34人，年齡32～55歲。取肝素鈉抗凝的外周血，用人淋巴細胞分離液(上海華精生物有限公司)密度梯度法分離，2 500 r/min離心25 min，分離獲取外周血單個核細胞(PBMCs)。

1.2HLA-A2表型的PCR-SSP法檢測HLA-A2位點特異性引物[1]由上海生工生物工程有限公司合成。第一對引物序列：上游5’-GCGCCGTG GAAGAGGGTCG-3’，下游5’-CCCGTCCCAATACTC CCGA-3’，擴增A基因5’端的236 bp。第二對引物序列：上游5’-GGTCCGGAGTATTGGGACG-3’，下游5’-GTGCTTGGTGGTCTGAGCT-3’，擴增A基因3’端的511 bp。用DNA提取試劑盒提取PBMCs DNA，提取的DNA樣本1.8≤A(260 nm)/A(280 nm)≤2.0，純度滿足后續(xù)實驗要求。以提取的DNA為模板，分別用兩對引物進行平行擴增。PCR反應體系：基因組DNA 0.5 μL，引物25 pmol，PCR-mix 10 μL，用ddH2O補足總體系至20 μL。反應條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3HLA-A2表型的流式細胞法檢測將每位受檢者的PBMCs平均分為兩份，分別置于樣品管和對照管，細胞離心棄上清后，在樣品管中加入2 μL anti-HLA-A2-PE、anti-CD3-FITC抗體，在對照管中加入2 μL anti-IgG-PE、anti-IgG-FITC抗體(抗體均為BD pharmingen公司產(chǎn)品)，避光孵育15 min,加入PBS重懸，洗去未結合的抗體，加入500 μL PBS重懸，上流式細胞儀(BD FACS Canto Ⅱ)檢測。

1.4統(tǒng)計學處理應用 SPSS 10.0進行統(tǒng)計學分析。基因頻率的計算采用直接計數(shù)法，兩樣本率的比較采用χ2檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1PCR-SSP和流式細胞法檢測結果的比較PCR-SSP電泳圖見圖1。采用流式細胞技術與PCR-SSP方法檢測72例正常對照、438例腫瘤患者、110例慢性丙型肝炎患者和97例白癜風患者HLA-A2的分布頻率，結果一致。

圖1 HLA-A2 PCR-SSP 分型電泳圖

2.2不同疾病患者HLA-A2抗原的分布正常對照、腫瘤患者、慢性丙型肝炎患者、白癜風患者HLA-A2抗原的分布頻率分別為48.6%、49.1%、39.0%、47.4%。腫瘤患者、慢性丙型肝炎患者、白癜風患者HLA-A2分布頻率分別與正常對照比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.006,1.611和0.230,P>0.05)。

2.3不同腫瘤患者HLA-A2抗原的分布438例腫瘤患者中，肺癌(91例)、腎癌(56例)和食管癌(126例)病例數(shù)均超過50，這3種腫瘤患者中HLA-A2抗原的分布頻率分別為42.9%、57.1%和38.0%，與正常對照比較，差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.537,0.919和2.081,P>0.05)。

3 討論

在免疫治療中，具有HLA限制性的CTL反應在抗腫瘤免疫和機體抗感染(如丙型肝炎)、移植排斥反應以及某些自身免疫疾病(如白癜風)等過程中發(fā)揮關鍵作用[4-5]。在腫瘤治療方面，CTL被認為是抗腫瘤免疫反應中最有效的效應群體。由于T 細胞只能識別與HLA分子結合的抗原肽段, 因而個體的T 細胞免疫反應能力很大程度上取決于其所攜帶的HLA分子。HLA-A2作為人類中分布最廣、表達最頻繁的MHC-Ⅰ類分子，分析其表達狀況，對于生物治療的進一步臨床應用具有很大意義。

HLA-A2是在人類中發(fā)現(xiàn)的最頻繁的特異性HLA-A分子之一，其擁有最多的異構等位基因，至今至少檢測到31個亞族。HLA-A2分子作為CTL識別的限制因子在親子關系鑒定和抗特殊病毒感染以及抗腫瘤中發(fā)揮了重要作用[6-8]。HLA-A2分子在各種腫瘤中表達的減少或缺失提示其在腫瘤免疫監(jiān)視與逃逸中發(fā)揮了重要作用[9]。HLA-A2在不同人群中的分布頻率不同，如在49.7%的美洲原住民、49.6%的高加索人、46.9%的西班牙人、36.0%的亞洲太平洋島民和34.6%的非洲裔美國人中表達[10]。HLA-A2也被發(fā)現(xiàn)在54.0%的中國人、42.4%的日本人、30.3%的非洲人[11]、26.0%的印度人和37.0%的新加坡華人[12]中表達。在腫瘤疫苗方面，MAGE、WT1、NY-ESO-1 等大批腫瘤抗原均為HLA-A2限制性抗原肽，均可在體內、外誘導特異性CTL反應，有效殺傷腫瘤細胞[2]，部分由這些抗原肽構成的疫苗已進入三期臨床試驗。在過繼細胞免疫治療方面能短時間內產(chǎn)生大量的CTL或基因改造的T細胞治療已成為新的熱點，絕大多數(shù)這些基因改造的T細胞治療也都是基于HLA-A2限制性的抗原肽誘導的CTL反應[3]。

隨著對疾病認識的不斷加深，人們越來越重視免疫系統(tǒng)在疾病的發(fā)生、治療中的作用。隨著鑒定方法的發(fā)展，越來越多的證據(jù)顯示HLA與多種疾病相關。李長秦等[13]證實HLA-A2抗原在HCV 感染供血員中的分布頻率顯著低于健康供血員。徐龍等[14]發(fā)現(xiàn)腎癌患者HLA-A2等位基因的表達高于正常人。作者比較了河南省病毒感染(丙型肝炎)、免疫疾病(白癜風)和癌癥患者中HLA-A2的分布頻率與正常對照的差異，結果顯示差異均無統(tǒng)計學意義。因此，在臨床上應用的HLA-A2限制性疫苗的設計更具廣泛性。

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(2013-05-22收稿 責任編輯王 曼)

Frequencies of HLA-A2 among patients with tumors，chronic hepatitis C and vitiligo in Henan Province

WANGHainan1,2)，QIYuanming1)，GAOYanfeng1),ZHOUZhejun1,2)，LIZhiqin3)，DUJunbo4)，LIJianbin5)，ZHANGYi1,2,6,7)

1)DepartmentofBioengineering，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)DepartmentofInfectiousDisease,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)DepartmentofDermatology,CentralHospital,JiaozuoCoalGroup,Jiaozuo454000 5)HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450053 6)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 7)InstituteofClinical-MedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

HLA-A2;tumor;immunotherapy;chronic hepatitis C;vitiligo

Aim: To investigate HLA-A2 frequencies in the patients either with cancer or chronic hepatitis C, or vitiligo in Henan Province.Methods: The frequencies of HLA-A2 in 72 healthy people, 438 patients with tumors, 110 patients with chronic hepatitis C, and 97 patients with vitiligo, were detected by flow cytometry and PCR sequence specific primer (PCR-SSP). Results: The frequencies of HLA-A2 in patients with tumors, chronic hepatitis C, and vitiligo were 49.1%, 39.0%, and 47.4%,respectively,which had no significant differences from that of 48.6% in the healthy people(χ2=0.006,1.611,0.230,P>0.05). The frequencies of HLA-A2 in patients with lung cancer(91 cases), gastric cancer(56 cases),and esophageal cancer(126 cases) were 42.9%,57.1% and 38.0%,which had no significant differences from that of the healthy people(χ2=0.537,0.919,2.081,P>0.05). Conclusion: HLA-A2 is widely expressed in Henan population and it is valuable of applying HLA-A2 restricted immunotherapy for Henan population.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.015

*國家自然科學基金資助項目 81171986，81271815；衛(wèi)生部科研攻關基金資助項目 20110110001；河南省科技廳基礎與前沿技術研究基金資助項目 112300410153，122300410155；河南省科技廳科技創(chuàng)新人才計劃項目 124200510006；鄭州大學第一附屬醫(yī)院院內創(chuàng)新團隊基金資助項目

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