β3腎上腺素能受體激動劑對小鼠脂肪細(xì)胞中UCP1和磷酸化p38蛋白表達(dá)的影響

孫高潔,王 姣,崔 巖,王守俊

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

β3腎上腺素能受體激動劑對小鼠脂肪細(xì)胞中UCP1和磷酸化p38蛋白表達(dá)的影響

孫高潔,王 姣,崔 巖,王守俊#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1967年11月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和防治，E-mail:wangshoujun02@126.com

β3腎上腺素能受體激動劑；脂肪細(xì)胞;解偶聯(lián)蛋白1;p38/MAPK通路；小鼠

目的：探討β3腎上腺素能受體激動劑CL-316243對脂肪細(xì)胞中解偶連蛋白1(UCP1)表達(dá)的影響。方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，分別采用常規(guī)培養(yǎng)基(空白對照組)、10 μmol/L p38/MAPK抑制劑SB203580(SB203580組)、10-7mol/L β3腎上腺素能受體激動劑CL-316243聯(lián)合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580組)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243組)處理。48 h后，RT-PCR法檢測4組細(xì)胞中UCP1 mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測空白對照組、CL-316243+SB203580組和CL-316243組細(xì)胞中p38蛋白磷酸化程度。結(jié)果CL-316243組、空白對照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組細(xì)胞中UCP1 mRNA的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001)，CL-316243組表達(dá)水平較其他3組明顯增高(P<0.05)。CL-316243組細(xì)胞中p38蛋白磷酸化程度較空白對照組和CL-316243+SB203580組升高(F=137.339,P<0.001)，后2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CL-316243可能通過激活p38/MAPK信號通路，促進(jìn)脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)。

隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高，肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高。人體內(nèi)有兩種脂肪組織，即白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)，WAT與BAT在能量代謝中發(fā)揮著截然相反的作用,WAT主要通過甘油三酯貯存能量, 而BAT則消耗能量[1]，高水平的BAT有助于減輕體重和維持機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)[2-3]。因此促使WAT向BAT轉(zhuǎn)化可能是一個治療肥胖癥比較有效的方法。目前研究[4]發(fā)現(xiàn),β3腎上腺素能受體激動劑可刺激WAT的脂解，也可誘導(dǎo)WAT向BAT的轉(zhuǎn)化。解偶聯(lián)蛋白1(unconpling protein 1,UCP1)是一種在BAT中特異表達(dá)的線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì),是決定棕色脂肪組織功能的關(guān)鍵因素[5-6]，因此，它可成為一個衡量WAT向BAT轉(zhuǎn)化的特異性指標(biāo)。作者觀察了選擇性β3腎上腺素能受體激動劑CL-316243對小鼠脂肪細(xì)胞中UCP1和p38/MAPK信號通路蛋白表達(dá)的影響，探討β3腎上腺素能受體激動劑對WAT棕色化的影響及作用機(jī)制，為肥胖癥、糖尿病等相關(guān)代謝性疾病的診治提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源和主要試劑小鼠前脂肪細(xì)胞株3T3-L1細(xì)胞購自武漢博士德公司。地塞米松(dexamethasone，Dex)、胰島素、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)和CL-316243均購自Santa Cruz公司；Trizol試劑購自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR Master Mix購自北京全式金公司;p38 MAPK抑制劑SB203580、p38抗體、磷酸化p38(p-p38)抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)成熟將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至完全融合后換用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，3 d后換用含1 μmol/L Dex、0.5 μmol/L胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，至第10天，約90%的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，經(jīng)油紅O染色鑒定，證實為脂肪細(xì)胞。

1.3實驗分組細(xì)胞分化成熟后，隨機(jī)分為4組，分別采用常規(guī)培養(yǎng)基(空白對照組)、10 μmol/L SB203580(SB203580組)、10-7mol/L CL-316243聯(lián)合10 μmol/L SB203580(CL-316243+SB203580組)、10-7mol/L CL-316243(CL-316243組)處理。

1.4細(xì)胞中UCP1mRNA的檢測細(xì)胞處理48 h后，采用RT-PCR法檢測UCP1 mRNA。根據(jù)GenBank中的UCP1(NM_009463.3)和內(nèi)參β-actin(NM_007393)基因序列設(shè)計引物， UCP1基因引物由寶生物公司合成，內(nèi)參β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UCP1引物序列：上游5’-CACTCAGGATTGGCCTCTACGAC-3’，下游5’-GCTCTGGGCTTGCATTCTGAC-3’；β-actin引物序列：上游5’-GTCCCTCACCTCCCAAAA-3’，下游5’-GCT GCCTCAACACCTCAACCC-3’。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55.7 ℃(UCP1)或64.5 ℃(β-actin)退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用UVP公司的VisionWorks LS軟件進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞中p-p38蛋白的檢測收集空白對照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組處理48 h的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用Western blot檢測p38、p-p38蛋白。SDS-PAGE膠上每泳道上樣37.5 μg蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗均稀釋1 000倍，搖床4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋1 000倍)孵育1 h，洗滌3次后DAB顯色。用UVP公司的VisionWorks LS軟件進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。以p-p38/p38×100%表示p38磷酸化的程度。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，4組間UCP1 mRNA表達(dá)水平的比較采用2×2析因設(shè)計的方差分析,3組間p38磷酸化程度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1油紅O染色鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 貼壁后(A)及分化后(B，油紅O染色)細(xì)胞的形態(tài)觀察(×100)

2.2 4組脂肪細(xì)胞中UCP1mRNA表達(dá)水平的比較見圖2及表1。CL-316243組細(xì)胞中UCP1 mRNA的表達(dá)水平較空白對照組、SB203580組和CL-316243+SB203580組明顯升高(P<0.05)。

2.3空白對照組、CL-316243+SB203580組和CL-316243組脂肪細(xì)胞中p38磷酸化程度的比較見圖3和表2。CL-316243組細(xì)胞中p38磷酸化程度較空白對照組、CL-316243+SB203580組明顯升高；后2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 4組脂肪細(xì)胞中UCP1 mRNA的表達(dá)

A:空白對照組；B：SB203580組；C:CL-316243+SB203580組；D:CL-316243組。

表1 4組細(xì)胞中UCP1 mRNA表達(dá)水平的比較(n=3)

FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,F交互=143.308,P<0.001。

圖3 3組細(xì)胞中p-p38蛋白的表達(dá)

A:空白對照組；C：CL-316243+SB203580組；D:CL-316243組。

表2 3組細(xì)胞中p38磷酸化程度的比較

F=137.339,P<0.001;*:與其他2組比較，P<0.05。

3 討論

β3 腎上腺素能受體主要調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪分解和產(chǎn)熱過程，它被激活后可上調(diào)UCP1的表達(dá),從而誘導(dǎo)WAT的棕色化[7]。已有文獻(xiàn)[8]指出，去甲腎上腺素刺激β3腎上腺素能受體后可激活cAMP-PKA通路，引起UCP1快速調(diào)節(jié)物(如FFA)的釋放，也可激活p38/MAPK通路，從而上調(diào)UCP1的表達(dá)。

該研究結(jié)果顯示，CL-316243組細(xì)胞中UCP1mRNA表達(dá)水平和p38磷酸化程度均較空白對照組明顯升高,說明CL-316243可促進(jìn)脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)和p38的磷酸化，激活p38/MAPK信號傳導(dǎo)通路；SB203580組細(xì)胞UCP1 mRNA表達(dá)水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明p38抑制劑本身并不會影響脂肪細(xì)胞中UCP1的表達(dá)；CL-316243組細(xì)胞中UCP1 mRNA表達(dá)水平和p38磷酸化程度均高于CL-316243+SB203580組，說明p38抑制劑SB203580確實抑制了p38的磷酸化，而之前已驗證p38抑制劑SB203580本身并不會影響UCP1的表達(dá)，所以p38/MAPK信號通路可能參與了CL-316243誘導(dǎo)UCP1表達(dá)的過程。

因此，可以看出，β3腎上腺素能受體激動劑在誘導(dǎo)WAT棕色化過程中發(fā)揮了一定的作用，這就為臨床上研究新型高效能的抗肥胖和糖尿病藥物提供了新的實驗依據(jù)。

[1]Tews D,Wabitsch M.Renaissance of brown adipose tissue[J].Horm Res Paediatr,2011,75(4):231

[2]孫慧,楊娜娜,黃雪芳,等.棕色脂肪組織特異性基因在抵抗肥胖中作用的研究[J].臨床消化病雜志,2013,25(1):3

[3]Asensio C,Jimenez M,Kühne F,et al.The lack of β-adrenoceptors results in enhanced insulin sensitivity in mice exhibiting increased adiposity and glucose intolerance[J].Diabetes,2005,54(12):3490

[4]Festuccia WT,Blanchard PG,Richard D,et al.Basal adrenergic tone is required for maximal stimulation of rat brown adipose tissue UCP1 expression by chronic PPAR-gamma activation[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2010,299(1):R159

[5]孫長顥,劉榮,聞穎,等.解偶聯(lián)蛋白在肥胖抵抗中的作用[J].中國公共衛(wèi)生,2004,20(2):171

[6]肖放,孫野青.解偶聯(lián)蛋白及功能研究進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2003,23(1):14

[7]劉昭前,孫紅,劉亞利,等.特異性 β3 腎上腺素能受體激動劑研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報,2005,21(10):1153

[8]Brondani LA,Assmann TS,Duarte GC,et al.The role of the uncoupling protein 1 (UCP1) on the development of obesity and type 2 diabetes mellitus[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2012,56(4):215

(2013-11-07收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of β3-adrenoceptor agonist on expression of UCP1 and phosphorylated p38 in mouse adipocytes

SUNGaojie，WANGJiao，CUIYan，WANGShoujun

DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

β3-adrenoceptor agonist;adipocyte;uncoupling protein 1;p38/MAPK;mouse

Aim: To investigate the effect of β3-adrenoceptor agonist CL-316243 on expression of uncoupling protein 1(UCP1) in mouse adipocytes. Methods: 3T3-L1 preadipocytes were induced into adipocytes,then the adipocytes were divided into four groups:blank control group, p38/MAPK inhibitor SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 combined with SB203580 group,10-7mol/L CL-316243 group.The adipocytes were treated with these regents for 48 h,then the expression level of UCP1 mRNA was evaluated by RT-PCR,and the phosphorylated p38(p-p38) was evaluated by Western blot. Results: The expression level of UCP1 mRNA in CL-316243 group was higher than those in the other 3 groups(FCL-316243=204.043,FSB203580=151.736,Finteraction=143.308,P<0.001).The p-p38 expression in CL-316243 group was higher than those in the blank control group and CL-316243 + SB203580 group(F=137.339,P<0.001)，but those in the other 2 groups had no statistical significance(P>0.05).Conclusion: β3-adrenoceptor agonist CL-316243 can promote the expression level of UCP1 in adipocytes through activating p38/MAPK signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.012

R589.2