人參皂甙Rb1對感染性休克大鼠重要器官的保護作用*

徐宏平，賈寶輝，艾啟帆，孫顧峰，汪嘉飛，劉 浩，劉祥玉，程 舒

1)鄭州鐵路職業(yè)技術學院 鄭州 450052 2)南昌大學第四臨床醫(yī)學院 南昌 330003

人參皂甙Rb1對感染性休克大鼠重要器官的保護作用*

徐宏平1)△，賈寶輝1)，艾啟帆2)，孫顧峰2)，汪嘉飛2)，劉 浩2)，劉祥玉2)，程 舒2)

1)鄭州鐵路職業(yè)技術學院 鄭州 450052 2)南昌大學第四臨床醫(yī)學院 南昌 330003

△男，1965年1月生，碩士，副教授，研究方向：內科急危癥，E-mail:1418608464@qq.com

人參皂甙Rb1；感染性休克；Toll樣受體4；腫瘤壞死因子-α；大鼠

目的：探討人參皂甙Rb1對感染性休克大鼠重要器官的保護作用及其機制。方法66只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、Rb1治療(0.04 mg/g)組，每組22只。模型組和Rb1治療組大鼠建立感染性休克動物模型。觀察3組大鼠肝、肺組織病理變化，檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量和心肌組織Toll樣受體4(TLR4)mRNA 表達的變化。結果模型組肝細胞腫脹、變性、壞死，中性粒細胞浸潤；Rb1治療組肝細胞濁腫，輕度變性，未見明顯壞死灶，肝血竇中中性粒細胞浸潤較輕。模型組部分肺泡上皮細胞腫脹，肺泡隔增寬，毛細血管明顯擴張淤血，微血栓形成，肺間質充血水腫，彌漫性中性粒細胞浸潤，肺泡腔內大量炎性滲出；Rb1治療組小血管及毛細血管內中性粒細胞浸潤較輕，肺間質輕度水腫，肺泡隔增寬不明顯，肺泡腔無滲出物。模型組血清TNF-α、心肌組織TLR4 mRNA水平高于假手術組，Rb1治療組兩指標低于模型組(P<0.01)。結論Rb1可保護感染性休克大鼠肝、肺組織，其機制可能與減少TLR4 mRNA表達水平，抑制TNF-α的產生有關。

膿毒癥及其相關病變感染性休克是一組嚴重的臨床綜合征，是當前ICU患者多器官功能衰竭和死亡的主要原因，也是危害人類生命健康的一個全球性難題。人參皂甙是人參的主要活性成分[1]，對全身各系統(tǒng)尤其是心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)有保護作用。Rb1是人參皂甙的主要活性成分[2]。該研究通過探討Rb1對感染性休克大鼠重要器官的保護作用及其機制，為應用Rb1治療感染性休克提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組66只健康雄性SD大鼠，體重130～170 g，由南昌大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、感染性休克模型組(以下簡稱模型組)和Rb1治療組，每組22只。每組中的16只用于觀察7 d生存率并記錄生存時間，6只用于檢測血氣、血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平、心肌組織中Toll樣受體4(TLR4) mRNA和主要組織病理學變化。在造模前30 min，治療組和模型組分別腹腔注射Rb1(0.04 mg/g)、等量生理鹽水，之后每間隔8 h追加注入，共3次。

1.2大鼠感染性休克模型的制備參考文獻[3]盲腸結扎加穿孔法制備感染性休克動物模型。以200 g/L烏拉坦(劑量1 g/kg)腹腔麻醉，于前腹正中作長2～3 cm切口，游離腸系膜和盲腸，3-0絲線環(huán)行結扎盲腸根部，9號針頭于盲端部位穿刺2處，兩針孔相距約3 mm，還納腸管，逐層縫合關腹。術畢，皮下注射生理鹽水(30 mL/kg)補充體液，碘伏消毒包扎傷口。假手術組動物除不行盲腸結扎和穿孔外，其余步驟同上。術后大鼠自由進食飲水。

1.3主要試劑注射用Rb1(20 mg/支，上海源葉生物科技有限公司)，大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，RNA提取試劑盒、RNA酶抑制劑(德國Boehringer Mannheim公司)，dNTP、AMV逆轉錄酶、DNA聚合酶(Taq酶)均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.4主要儀器生命體征監(jiān)護儀(型號Bene View T5，深圳邁瑞公司)，壓力傳感器(型號MMBPTSA20，北京天地和協(xié)科技有限公司)，450 nm酶標儀(美國Bio-Rad公司)，UV-1601分光光度儀(日本SANYO公司)，DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、電泳槽、DYY-7B型轉移電泳儀(北京六一儀器廠)，多功能血氣分析儀(i-STAT，美國)，基因體外擴增儀(洛陽華美公司)，電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)等。

1.5觀察項目及方法記錄3組動物造模后7 d內生存率。造模成功后4 h經右側頸動脈穿刺采集血樣，應用血氣分析儀測定動脈血血氣；取部分血樣，加入EDTA抗凝管，離心(3 000g，4 ℃)15 min后，取上清保存于-70 ℃。采用ELISA法測定血清TNF-α水平。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.6大鼠心肌組織中TLR4mRNA的檢測造模成功后4 h處死動物取心肌組織，提取組織RNA，采用RT-PCR方法檢測心肌組織TLR4 mRNA含量。大鼠TLR4上游引物序列：5’-GTCCATCGGTT GATCTTGGA-3’，下游引物序列：5’-TTAAAAATG GCTGGCAATTCT-3’，擴增產物大小為681 bp。β-actin上游引物序列：5’-ACCACAGCTGAGAGG GAAATCG-3’；下游引物序列5’-AGAGGTCTTTACG GATGTCAACG-3’，擴增產物大小為281 bp。PCR反應條件：93 ℃變性1 min，57 ℃退火2 min，72 ℃擴增1 min，共30個循環(huán)。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析，以目的基因條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示mRNA的相對表達量。

1.7病理學檢查造模成功后4 h處死動物取肝、肺組織。石蠟包埋切片，經HE染色后在普通光學顯微鏡下觀察。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行分析。應用χ2檢驗比較3組大鼠總體生存率的差異，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較3組大鼠心肌組織TLR4 mRNA和血清TNF-α的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組大鼠總體生存率比較見表1。

表1 3組大鼠總體生存率比較 只(%)

*:χ2=30.378，P<0.001。

2.2 3組大鼠動脈血氣分析結果見表2。

表2 3組大鼠動脈血氣分析比較

*:與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.3 3組大鼠肝、肺組織病理學改變

2.3.1 肝組織 見圖1上排。假手術組肝細胞結構完整，肝小葉形態(tài)正常，肝血竇無擴張和炎性細胞浸潤。模型組肝細胞腫脹、空泡樣脂肪變性，點狀或小片狀壞死。肝臟門管區(qū)局灶性膿腫，肝血竇擴張，中性粒細胞浸潤于血管壁。Rb1治療組肝細胞濁腫，輕度脂肪變性，未見明顯壞死灶。肝血竇中中性粒細胞浸潤較輕。

2.3.2 肺組織 見圖1下排。假手術組肺泡上皮細胞形態(tài)正常，肺間隔未見增寬，毛細血管無充血和淤血，肺間質未見出血、水腫及炎性細胞浸潤，肺泡大小均勻，結構完整。模型組部分肺泡上皮細胞腫脹，肺泡隔增寬，毛細血管明顯擴張淤血，微血栓形成，肺間質充血水腫，彌漫性中性粒細胞浸潤，肺泡腔變小，部分區(qū)域肺萎縮，肺泡腔內大量炎性滲出。Rb1治療組小血管及毛細血管內中性粒細胞浸潤較輕，肺間質輕度水腫，肺泡隔增寬不明顯，肺泡腔無滲出物。

圖1 3組大鼠肝(上排)、肺(下排)組織病理學改變(HE,×200)

2.4 3組大鼠血清TNF-α和心肌組織TLR4mRNA水平的比較見表3。

表3 3組大鼠血清TNF-α和心肌組織TLR4 mRNA水平比較

*:與假手術組比較，P<0.01；#：與模型組比較，P<0.01。

3 討論

內毒素是引起敗血癥/感染性休克的重要致病因子之一，其化學本質為脂多糖(LPS)。LPS與存在于體內的單核/巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞以及內皮細胞等膜上的受體結合，通過細胞內信號轉導機制，啟動細胞炎癥反應，導致多種炎性細胞因子如TNF-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等的大量生成，這些炎性細胞因子可進一步作用到其他細胞，引起炎癥反應擴大，形成所謂“瀑布效應”，導致全身性過度炎癥反應綜合征。這一機制是敗血癥/感染性休克的主要發(fā)病機制[4]。

單核/巨噬細胞被激活并釋放炎癥因子是膿毒癥/感染性休克的主要發(fā)病機制。當機體受到各種感染或非感染因素刺激后，TNF-α在循環(huán)中最早出現(xiàn)并迅速達到高峰，通過激活細胞因子網絡系統(tǒng)而誘發(fā)全身性過度炎癥反應。血清TNF-α含量的高低與多器官功能障礙綜合征的發(fā)生及其嚴重程度有良好的相關性[5-6]。

LPS進入體內后主要與CD14、TLRs等結合參與炎癥信號的轉導[7]。TLRs是一組具有信號轉導功能的跨膜蛋白質，廣泛分布于動物肝、肺、腎、心、脾等多種組織中。TLRs是完整的LPS信息轉導體，目前被認為是主要的LPS功能受體[8]。其中TLR4是介導LPS激活各種免疫效應細胞的敏感受體[9]。

杜曉輝等[10]研究證實，膿毒癥可迅速上調心肌組織TLR4、MD-2基因的廣泛表達，同時TLR4、MD-2基因表達上調又能促進LPS刺激局部組織合成、釋放TNF-α，從而可能共同參與了機體失控性炎癥反應的病理生理過程。尹海燕等[11]的研究也證實內毒素血癥時心肌組織TLR4表達增加。該研究結果顯示感染性休克大鼠4 h血清TNF-α水平明顯升高，心肌組織TLR4 mRNA表達亦明顯增加。這與感染性休克時內毒素活化心肌細胞內的信號轉導通路，促進細胞表面TLR4基因表達上調，從而促進炎性細胞因子的合成有關。

人參是中國傳統(tǒng)補氣血中藥，性味甘平，能補益臟腑之氣。人參的主要有效成分為人參皂甙，它具有廣泛的藥理作用。人參皂甙有30多種, 目前研究較多的有人參皂甙Rb1、人參皂甙Re、人參皂甙Rg1。呂文偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)：人參皂苷Rg2對結扎冠脈犬所致的心源性休克具有增加心輸出量、心臟指數(shù)、心搏指數(shù)，改善心源性休克犬心功能，有正性肌力作用，而且均能增加血氧含量，改善心肌的供氧。柴惠等[13]研究證實：人參皂甙Rb1可抑制人臍靜脈內皮中TNF-α引起的細胞炎癥反應的發(fā)生。

該研究顯示：人參皂甙Rb1治療可明顯提高感染性休克大鼠的存活率，并且還能改善感染性休克大鼠動脈血酸堿度和氧分壓水平，明顯減輕肝、肺組織的病理損害。提示人參皂甙Rb1對感染性休克動物具有保護作用。作者進一步探討了這種保護作用的分子機制，結果發(fā)現(xiàn)Rb1治療組血清TNF-α水平與心肌組織TLR4 mRNA表達水平均低于模型組。說明Rb1是通過作用于感染性休克時內毒素活化的細胞內的信號轉導通路，抑制細胞表面TLR4基因表達，拮抗炎性細胞因子的合成而實現(xiàn)的。這與呂夢捷等[14]報道人參皂甙Rb1通過抑制內毒素信號轉導，調節(jié)巨噬細胞因子的分泌、抑制其活化一致。

總之，人參皂甙Rb1可有效拮抗敗血癥/感染性休克的全身炎性反應綜合征，這為將含人參皂苷Rb1成分的中藥如三七、人參等更好地應用于臨床治療敗血癥、感染性休克及多器官功能障礙綜合征等提供了新的思路和研究方向。

[1]王春剛,賈曉晶,董麗華,等.西洋參葉三醇組皂苷對乳腺癌放療患者外周血免疫球蛋白、補體水平及淋巴細胞CD4、CD8和CD25表達的影響[J].吉林大學學報:醫(yī)學版,2005,31(2):287

[2]Lee SH,Hur J,Lee EH,et al.Ginsenoside Rb1 modulates level of monoamine neurotransmitters in mice frontal cortex and cerebellum in response to immobilization stress[J].Biomol Ther(Seoul),2012,20(5):482

[3]金惠銘.盲腸結扎穿刺后的大鼠敗血癥模型[J].中國病理生理雜志,1990,6(2):126

[4]Matsuda A,Jacob A,Wu R,et al.Novel therapeutic targets for sepsis: regulation of exaggerated inflammatory responses[J].J Nippon Med Sch,2012,79(1):4

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[14]呂夢捷,曾耀英,宋兵.人參皂甙Rb1對小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬及細胞因子和NO分泌的影響[J].細胞與分子免疫學雜志,2011,27(3):242

(2013-06-09收稿 責任編輯趙秋民)

Protective effect of ginsenoside Rb1 on septic shock rats

XUHongping1),JIABaohui1),AIQifan2),SUNGufeng2),WANGJiafeng2),LIUHao2),LIUXiangyu2),CHENGShu2)

1)ZhengzhouRailwayTechnologyVocationCollege,Zhengzhou450052 2)TheFourthHospitalAttachedtoNanchangUniversity,Nanchang330003

ginsenoside Rb1;septic shock;Toll like receptor 4;TNF-α;rat

Aim: To observe the protective effect of ginsenoside Rb1 on vital organs in rats with septic shock.Methods: The septic shock model was reproduced by CLP. Sixty-six SD rats were randomly divided into three groups(22 in each group): sham group, CLP group and ginsenoside Rb1 group(0.04 mg/g). The liver and lung samples were prepared for observation of pathological changes; the expression of Toll like receptor 4(TLR4) mRNA in myocardial tissue was determined by RT-PCR; the serum tumor necrosis factor-α(TNF-α) was measured by ELISA.Results: In CLP group, pathological results showed swelling, degeneration, necrosis and neutrophil infiltration in the liver cells,which were milder in ginsenoside Rb1 group. Moreover, in CLP group, there were swelling in alveolar epithelial cells, thickening in alveolar septum, expansion and congestion in capillaries, microthrombosis, congestion and edema in pulmonary interstitial, diffuse infiltration of neutrophils and diminished alveolar space with heavy inflammatory exudation,which were milder in ginsenoside Rb1 group.The TLR4 mRNA in myocardial tissue and serum TNF-α in CLP group were significantly higher than those in sham group(P<0.01). The ginsenoside Rb1 group had markedly lower TLR4 mRNA expression and TNF-α level than the CLP group(P<0.01).Conclusion: Ginsenoside Rb1 could protect the liver and lung tissue of septic shock rats through down-regulating the expression of TLR4 mRNA and inhibiting the produce of TNF-α.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.007

*河南省科技廳基礎與前沿項目 102300410163；河南省教育廳科學技術研究重點項目 13B320290；南昌大學第十三屆“挑戰(zhàn)杯”大學生課外學術科技作品

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