羥基喜樹堿脂質體與順鉑聯用對耐順鉑的人食管癌Eca109細胞周期和凋亡的影響*

戴翠萍，張徐寧，薛彩萍，劉家秀，張玉領，楊學藝，陳文中，季寧東

1)淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術學?；窗彩邢滥[瘤重點實驗室 淮安 223300 2)南京思科藥業(yè)有限公司 南京 210061

羥基喜樹堿脂質體與順鉑聯用對耐順鉑的人食管癌Eca109細胞周期和凋亡的影響*

戴翠萍1)△，張徐寧1)，薛彩萍1)，劉家秀1)，張玉領1)，楊學藝1)，陳文中2)，季寧東1)

1)淮陰衛(wèi)生高等職業(yè)技術學?；窗彩邢滥[瘤重點實驗室 淮安 223300 2)南京思科藥業(yè)有限公司 南京 210061

△女，1972年10月生，碩士，副教授，研究方向：消化道腫瘤，E-mail：38224722@qq.com

羥基喜樹堿脂質體；順鉑；食管癌；細胞周期；細胞凋亡

目的：研究羥基喜樹堿脂質體(LHCPT)與順鉑(DDP)聯用對耐DDP的人食管癌細胞Eca109細胞(Eca109/DDP)細胞周期和凋亡的影響。方法取對數生長期的Eca109/DDP細胞，分別用0、1 mg/L DDP處理，再用0.00、0.49、0.98、1.96、3.92、7.84 μg/L LHCPT處理72 h，MTT法測定細胞增殖狀況。取對數生長期的Eca109/DDP細胞，分別用0、1 mg/L DDP處理后，再用0.00、3.92 μg/L LHCPT處理72 h，用流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡情況。結果相對于單獨應用，LHCPT與DDP聯合應用抑制了Eca109/DDP細胞的增殖(FLHCPT=40.330，FDDP=641.010，F交互=20.330，P均<0.001)，以3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯用效果最佳(P<0.05)。相對于單獨應用，3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯用可阻滯Eca109/DDP細胞在G0/G1期(FLHCPT=16.184，FDDP=33.660，F交互=15.100，P均<0.05)，同時增加細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率(P均<0.05)，二者具有協(xié)同效應。結論LHCPT具有輔助DDP治療食管癌的作用。

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人體健康。順鉑(cisplatin，DDP)為臨床治療食管癌的主要化療藥物之一，但往往因多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)影響了其對耐藥細胞株的療效。研究發(fā)現，抗腫瘤藥物的療效主要取決于其激活細胞凋亡的能力[1]，而脂質體具有促進腫瘤細胞凋亡的作用[2-3]，但未見羥基喜樹堿脂質體(hydroxycamptothecin liposome，LHCPT)對食管癌耐藥細胞作用的研究報道。作者用耐DDP的食管癌細胞Eca109/DDP為模型，觀察LHCPT與DDP聯合應用對Eca109/DDP細胞周期和細胞凋亡的影響，為將LHCPT用于臨床食管癌的輔助化療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要儀器、藥品和試劑LHCPT(南京思科藥業(yè)有限公司)，注射用DDP(規(guī)格5 g/L，山東齊魯制藥有限公司)，RPMI 1640(美國 Gibco公司)，MTT(美國 Amresco公司)，DMSO(上海久億化學試劑有限公司)，其他試劑均為國產分析純。細胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。酶標儀(美國 BioTek ELx800)，Western電泳儀(美國 Bio-Rad 164-5051)，高速冷凍離心機(德國 SORVALL D-37520)，CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(日本 SANYO XD-101)，流式細胞儀(美國 FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.2細胞株食管癌細胞株Eca109購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，耐DDP食管癌細胞株Eca109/DDP由實驗室用遞增藥物質量密度持續(xù)作用誘導法誘導Eca109細胞6個月構建而成，耐藥指數為15.89[4]。細胞用含體積分數為10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、飽和濕度及體積分數5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.3LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞增殖影響的觀察取對數生長期的Eca109/DDP細胞，以2.5 g/L的胰酶消化，調整細胞密度為5×104mL-1，5×103個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分別用0、1 mg/L的DDP處理，再用0.00、0.49、0.98、1.96、3.92、7.84 μg/L的LHCPT處理，每組5個復孔。培養(yǎng)72 h后，MTT法測定各孔吸光度(A)。

1.4LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞周期和細胞凋亡影響的觀察取對數生長期的細胞，胰酶消化，調整細胞濃度為1×106mL-1，1×106個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分別用0、1 mg/L的DDP處理，再用0.00、3.92 μg/L的LHCPT處理，每組5個平行復孔。培養(yǎng)72 h后，用流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡情況[5]。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0處理數據，應用析因設計的方差分析比較LHCPT、DDP單用及聯用對細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡影響的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞增殖的影響各組MTT法測得的A值見表1。結果顯示，相對于DDP單獨應用，LHCPT與DDP聯用抑制了Eca109/DDP細胞的增殖，以3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯用效果最佳。

表1 LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞增殖的影響

FLHCPT=40.330，FDDP=641.010，F交互=20.330，P均<0.001。

2.2LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞周期的影響各組細胞周期測定結果見表2。結果顯示，相對于DDP單獨應用，LHCPT與DDP聯用組G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，LHCPT與DDP具有協(xié)同效應。

表2 LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞周期的影響 %

2.3LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞凋亡的影響各組細胞凋亡測定結果見表3。結果顯示，相對于DDP單獨應用，LHCPT與DDP聯用組Eca109/DDP細胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均增加，LHCPT與DDP具有協(xié)同效應。

表3 LHCPT、DDP單用及聯用對Eca109/DDP細胞凋亡的影響 %

3 討論

腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多基因相互作用的結果，在生物學上表現為細胞凋亡障礙和細胞周期調控機制的紊亂。研究[6-10]表明，誘導食管癌細胞凋亡和周期改變可抑制食管癌細胞的增殖。因此選擇有效藥物誘導食管癌細胞凋亡和周期改變是提高食管癌療效的關鍵因素之一。

脂質體作為藥物載體在藥物傳遞系統(tǒng)中的研究較多，其本身對人體無毒性和免疫抑制作用，但具有明顯的靶向作用、緩釋作用、生物膜親和性和組織相容性、提高藥物穩(wěn)定性的特點。國內外研究表明脂質體具有促進細胞凋亡[2-3]和逆轉腫瘤MDR的作用[11-13]。作者將LHCPT與臨床一線抗癌藥DDP聯合應用，觀察其對耐DDP的食管癌細胞Eca109/DDP的增殖抑制作用，并探討其機制。研究結果表明，LHCPT與DDP聯合應用對Eca109/DDP細胞的增殖抑制有協(xié)同效應，以3.92 μg/L LHCPT與1 mg/L DDP聯合應用對Eca109/DDP細胞的增殖抑制作用最強。進一步對細胞周期和細胞凋亡的檢測結果顯示，與單獨應用相比，3.92 μg/L的LHCPT與1 mg/L DDP聯合應用組G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，同時細胞早期凋亡率和晚期凋亡率、總凋亡率均顯著增加。研究結果說明LHCPT與DDP聯合應用能誘使Eca109/DDP細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，通過改變Eca109/DDP細胞周期、增加細胞凋亡，從而抑制Eca109/DDP細胞的增殖，LHCPT與DDP有明顯的協(xié)同效應。臨床上如果將LHCPT與DDP聯合應用可起到提高DDP藥效、降低DDP用藥劑量的作用，這將有助于克服單獨應用DDP所引起的毒副作用大、容易發(fā)生耐藥等缺點，兩藥聯用將會使DDP的應用更加安全，低濃度的LHCPT具有輔助DDP治療食管癌的潛力。

目前認為細胞凋亡存在三條通路，即線粒體通路[14]、死亡受體通路[15]和內質網通路[16]，三條通路間密切關聯。其中，線粒體被視為細胞死亡調控的關鍵元件，是多種促細胞凋亡信號轉導分子的靶點。LHCPT與DDP聯用對Eca109/DDP細胞凋亡通路的影響將是進一步研究的方向，同時今后也要進一步加強兩藥聯用對食管癌實體瘤影響的研究。

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(2013-08-18收稿 責任編輯王 曼)

Effects of hydroxycamptothecin liposome combined with cisplatin on cell cycle and apoptosis of cisplatin-resistanted human esophageal carcinoma Eca109 cell

DAICuiping1),ZHANGXuning1),XUECaiping1),LIUJiaxiu1),ZHANGYuling1),YANGXueyi1),CHENWenzhong2),JINingdong1)

1)Huai’anKeyLaboratoryofTumorinDigestiveSystem,HuaiyinAdvancedVocationalandTechnicalHealthSchool,Huai’an223300 2)NanjingSikeMedicalCo.Ltd.，Nanjing210061

hydroxycamptothecin liposome;cisplatin;esophageal carcinoma;cell cycle;cell apoptosis

Aim: To investigate the effects of hydroxycamptothecin liposome(LHCPT) combined with cisplatin(DDP) on cell cycle and apoptosis of DDP-resistanted human esophageal carcinoma cell Eca109(Eca109/DDP).Methods:Eca109/DDP cells were treated with 0,1 mg/L DDP,and then treated with 0.00,0.49,0.98,1.96,3.92,7.84 μg/L LHCPT for 72 h, respectively;MTT method was applicated to detect the cell proliferation.Eca109/DDP cells were treated with 0,1 mg/L DDP,and then treated with 0.00,3.92 μg/L LHCPT for 72 h, respectively;flow cytometry was used to study the cell cycle and apoptosis.Results:Compared with single drug treatment, the growth inhibition effect on Eca109/DDP cells in LHCPT+DDP group was significant(FLHCPT=40.330，FDDP=641.010，Finteraction=20.330，P<0.001),especially 3.92 μg/L LHCPT+1 mg/L DDP.Compared with single drug treatment, 3.92 μg/L LHCPT+1 mg/L DDP could significantly block Eca109/DDP cells at G0/G1phase(FLHCPT=16.184，FDDP=33.660，Finteraction=15.100，P<0.05), and increase the early apoptotic rate，late apoptotic rate and total apoptotic rate(P<0.05).Conclusion: LHCPT has the potential to be an adjunct to chemotherapy for esophageal carcinoma.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.002

*江蘇省衛(wèi)生職業(yè)教育研究指導性項目 JZ200911;淮安市科技支撐計劃項目 HAS2009002-5

R735.1