Smo siRNA對人食管癌EC9706細胞凋亡及Smo、bcl-2基因表達的影響*

郭愛葉，丁胭脂，張 虎，張紅新，陳奎生#

1)河南省人民醫(yī)院檢驗科 鄭州 450003 2)河南省腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450003 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科；河南省腫瘤病理重點實驗室 鄭州 450052

SmosiRNA對人食管癌EC9706細胞凋亡及Smo、bcl-2基因表達的影響*

郭愛葉1)，丁胭脂2)，張 虎3)，張紅新3)，陳奎生3)#

1)河南省人民醫(yī)院檢驗科 鄭州 450003 2)河南省腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450003 3)鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科；河南省腫瘤病理重點實驗室 鄭州 450052

#通訊作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：腫瘤病理，E-mail:chenksh2002@163.com

Smo；bcl-2；食管癌；凋亡

目的：探討Smo siRNA對人食管癌EC9706細胞凋亡及凋亡相關基因bcl-2表達的影響。方法設計并合成Smo siRNA-3，轉染食管癌EC9706細胞后，分別采用RT-PCR和Western blot法檢測細胞中Smo、bcl-2 mRNA和蛋白的表達；采用TUNEL法及流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡指數(AI)和凋亡細胞比例。以未轉染、無關序列siRNA轉染和轉染試劑的細胞作對照。結果與各對照組相比，Smo siRNA-3轉染細胞24、48和72 h后EC9706細胞中Smo、bcl-2 mRNA的表達均明顯降低(P<0.05)，以轉染72 h降低最顯著(P<0.05)。與各對照組相比，Smo siRNA-3轉染72 h后細胞中Smo、bcl-2蛋白的表達均明顯降低(F=151.310、143.190，P<0.001)，AI增加(F=66.270，P<0.001)，早期和晚期凋亡細胞比例均增加(F=101.100、334.990，P<0.001)。結論Smo siRNA可能通過抑制細胞中Smo基因表達，進而下調bcl-2表達，促進EC9706細胞凋亡。

Hedgehog(Hh)信號通路是調控細胞增殖和組織分化的重要信號通路，Smoothened(Smo)蛋白是Hh信號通路上的膜蛋白，它把細胞外的Hh信號轉換成細胞內的Gli信號, 進而激活Hh相應基因(如bcl-2等)的轉錄，影響細胞凋亡[1]。該研究中作者觀察了RNA干擾沉默Smo基因對人食管鱗狀細胞癌細胞株EC9706凋亡相關基因bcl-2表達及細胞凋亡的影響，以期為食管癌的基因治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料EC9706細胞由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室贈送。LipofectamineTM2000及Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒購自Fermentas公司，Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Smo、bcl-2、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，RPMI 1640培養(yǎng)液由北京索萊寶科技有限公司提供，TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司，Smo、β-actin一抗及bcl-2兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。Smo siRNA(包括3條不同的Smo siRNA、無關序列siRNA)由上海吉瑪公司合成，序列見表1。

表1 3條Smo siRNA 的序列

1.2細胞培養(yǎng)將EC9706細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液(含體積分數10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U/mL)，于37 ℃、體積分數5%CO2孵箱內培養(yǎng)。

1.3實驗分組將EC9706細胞以4.5×105mL-1的密度接種于6孔板中，細胞覆蓋率達30%～50%時，利用LipofectamineTM2000分別轉染3條Smo siRNA，結果Smo siRNA-3的抑制效率最好，故選擇Smo siRNA-3用于實驗。實驗設Smo siRNA-3轉染24、48、72 h組，無關序列siRNA轉染組，轉染試劑組和未轉染對照組，每組5個復孔。

1.4細胞中Smo、bcl-2mRNA的RT-PCR法檢測收集上述6組細胞，用Trizol提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR。Smo 上游引物序列為5’-CGCTACCCTGCTGT TATTCTCT-3’，下游引物序列為5’-CAGGTGGAAG TAGGAGGTCTTG-3’,產物大小為306 bp；bcl-2上游引物序列為5’-AACTCGAGTGACAAGCCCGATG-3’，下游引物序列為5’-GTACCACCAGTTGGTTGTCTTT GA-3’,產物大小為201 bp；內參β-actin上游引物序列為5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3’，下游引物序列為5’-GAGCTACGAGCTGCTGCCTGACG-3’,產物大小為416 bp。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，63 ℃(Smo)/68 ℃(bcl-2)/67 ℃(β-actin)退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Alpha多功能凝膠成像系統(tǒng)成像，用Alpha View軟件進行圖像分析，以目的基因與β-actin電泳條帶吸光度(A)值的比值表示目的基因mRNA的表達水平。

1.5細胞中Smo、bcl-2蛋白的Westernblot法檢測收集Smo siRNA-3轉染72 h組、無關序列siRNA轉染組、轉染試劑組和未轉染對照組細胞，經胰酶消化離心，冰上裂解，提取蛋白質，采用BCA法測定蛋白濃度，Western blot法檢測Smo、bcl-2蛋白。一抗按1 000倍稀釋，二抗按5 000倍稀釋。DAB顯色。圖像分析同1.4，以目的蛋白與β-actin條帶A值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.6細胞凋亡檢測

1.6.1 TUNEL法 收集Smo siRNA-3轉染72 h組、無關序列siRNA轉染組、轉染試劑組和未轉染對照組細胞，制備細胞爬片， 滴加50 μL TUNEL反應混合液，37 ℃避光孵育1 h；滴加Converter-POD 50 μL，37 ℃避光孵育；DAB顯色，鏡下控制顯色時間，蘇木素復染。于高倍鏡(×400)下選取10個視野，每個視野計數200個細胞，計數視野內凋亡細胞數，求平均數。凋亡指數(apoptosis index,AI)=(凋亡細胞數/200)×100%。

1.6.2 流式細胞術法 收集Smo siRNA-3轉染72 h組、無關序列siRNA轉染組、轉染試劑組和未轉染對照組細胞(保證細胞密度>1×106mL-1)。PBS洗滌3遍，用100 μL預冷的Binding緩沖液重懸細胞，加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻避光孵育15 min，再加入400 μL Binding緩沖液混勻后，上流式細胞儀檢測。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理，組間Smo、bcl-2 mRNA和蛋白表達水平及AI、凋亡細胞比例的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 6組細胞中Smo及bcl-2mRNA的表達見圖1和表2?？梢钥闯觯琒mo siRNA-3轉染后細胞Smo和bcl-2 mRNA表達水平均較對照降低，以轉染72 h降低最顯著。

圖1 6組細胞中Smo及bcl-2 mRNA的表達

M：DNA Marker；1：未轉染對照組；2：轉染試劑組；3：無關序列siRNA轉染組；4～6：Smo siRNA-3轉染24、48、72 h組。

表2 6組細胞中Smo及bcl-2 mRNA的表達

*:與未轉染對照組、轉染試劑組和無關序列siRNA轉染組相比，P<0.05；Smo siRNA-3轉染組間兩兩比較，P<0.05。

2.2 4組細胞中Smo及bcl-2蛋白的表達見圖2和表3?？梢钥闯觯琒mo siRNA-3轉染72 h后細胞Smo和bcl-2蛋白表達水平較對照明顯降低。

1：未轉染對照組；2：轉染試劑組；3：無關序列siRNA轉染組；4：Smo siRNA-3轉染72 h組。

表3 4組細胞中Smo和bcl-2蛋白的表達

*:與未轉染對照組、轉染試劑組和無關序列siRNA轉染組相比，P<0.05。

2.3 4組細胞凋亡檢測結果見圖3和表4。Smo siRNA-3轉染72 h組AI、流式細胞術測得的晚期凋亡細胞和早期凋亡細胞比例均明顯大于其他3組。

圖3 細胞凋亡TUNEL法染色圖(×400)

表4 細胞凋亡檢測結果 %

*:與未轉染對照組、轉染試劑組和無關序列siRNA轉染組相比，P<0.05。

3 討論

近年來的研究[2-7]表明，多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與Hh信號通路的異常激活及過表達有著密切的關系，如肺小細胞癌、基底細胞癌、膀胱癌、胰腺癌、髓母細胞瘤、肝癌、前列腺癌、胃癌、乳癌等。通過抑制Hh信號轉導通路關鍵基因進而抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡已成為研究熱點。

Smo基因是一個原癌基因，位于染色體7q31-7q32，編碼一個含有1 024個氨基酸的蛋白。Smo蛋白有3個區(qū)域：細胞內羧基端區(qū)域、細胞外氨基端區(qū)域和疏水跨膜區(qū)[8]。當Hh蛋白不存在時，受體蛋白Ptch抑制Smo蛋白的活性，進而阻斷Hh信號通路[9]。當Hh蛋白存在時，Hh蛋白與Ptch蛋白結合，解除了對Smo蛋白的抑制，激活的Smo 蛋白可以把細胞外的Hh信號轉換成細胞內的Gli信號，進而激活相應基因的轉錄，包括Hhip、ptch、Gli1、cyclinD、Bmi1、bcl-2等[10]。相關研究[11-15]表明，采用siRNA抑制胃癌MGC803細胞、乳癌MCF-7細胞、肝癌Huh-7細胞、胰腺癌PANC-1細胞中Smo和Gli1的表達，可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，表明Smo可能是腫瘤基因治療的有效靶點。

前期研究結果表明[16-17]，Smo在人食管鱗狀細胞癌及裸鼠食管癌移植瘤組織中高表達；Smo siRNA可通過下調癌細胞中Smo 基因的表達, 誘導裸鼠食管癌移植瘤細胞的凋亡。該研究中作者設計合成了Smo siRNA-3，其可在蛋白和mRNA水平上有效抑制EC9706細胞中Smo和bcl-2的表達；TUNEL法及流式細胞術檢測結果顯示，Smo siRNA-3轉染72 h后，EC9706細胞凋亡明顯增加。實驗結果說明，沉默Smo基因表達可以促進EC9706細胞的凋亡，該作用可能由bcl-2介導。

綜上所述，Smo siRNA沉默Smo基因表達，可通過下調EC9706細胞中bcl-2的表達促進細胞凋亡。Smo有望成為食管癌基因治療的靶點。

[1]Jiang J,Hui CC.Hedgehog signaling in development and cancer[J].Dev Cell,2008,15(6):801

[2]Watkins DN,Berman DM,Burkholder SG,et al.Hedgehog signalling within airway epithelial progenitors and in small-cell lung cancer[J].Nature,2003,422(6929):313

[3]Thayer SP,di Magliano MP,Heiser PW,et al.Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis[J].Nature,2003,425(6960):851

[4]Sicklick JK,Li YX,Jayaraman A,et al.Dysregulation of the Hedgehog pathway in human hepatocarcinogenesis[J].Carcinogenesis,2006,27(4):748

[5]Karhadkar SS,Bova GS,Abdallah N,et al.Hedgehog signalling in prostate regeneration, neoplasia and metastasis[J].Nature,2004,431(7009):707

[6]Berman DM,Desai N,Wang X,et al.Roles for Hedgehog signaling in androgen production and prostate ductal morphogenesis[J].Dev Biol,2004,267(2):387

[7]Moraes RC,Zhang X,Harrington N,et al.Constitutive activation of smoothened (SMO) in mammary glands of transgenic mice leads to increased proliferation, altered differentiation and ductal dysplasia[J].Development,2007,134(6):1231

[8]Fiaschi M,Rozell B,Bergstr?m A,et al.Development of mammary tumors by conditional expression of GLI1[J].Cancer Res,2009,69(11):4810

[9]Liao X,Siu MK,Au CW,et al.Aberrant activation of hedgehog signaling pathway in ovarian cancers: effect on prognosis, cell invasion and differentiation[J].Carcinogenesis,2009,30(1):131

[10]Watson S,Serrate C,Vignot S.Sonic Hedgehog signaling pathway: from embryology to molecular targeted therapies[J].Bull Cancer,2010,97(12):1477

[11]Li SH,Fu J,Watkins DN,et al.Sulforaphane regulates self-renewal of pancreatic cancer stem cells through the modulation of Sonic hedgehog-GLI pathway[J].Mol Cell Biochem,2013,373(1/2):217

[12]Wang XD,Inzunza H,Chang H,et al.Mutations in the Hedgehog pathway genes SMO and PTCH1 in human gastric tumors[J].PLoS One,2013,8(1):e54415

[13]Agyeman A,Mazumdar T,Houghton JA.Regulation of DNA damage following termination of Hedgehog (HH) survival signaling at the level of the GLI genes in human colon cancer[J].Oncotarget,2012,3(8):854

[14]Ding YL,Wang QS,Zhao WM,et al.Expression of smoothened protein in colon cancer and its prognostic value for postoperative liver metastasis[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(8):4001

[15]Tao Y,Mao J,Zhang Q,et al.Overexpression of Hedgehog signaling molecules and its involvement in triple-negative breast cancer[J].Oncol Lett,2011,2(5):995

[16]李俊平,陳奎生.SMO蛋白及mRNA在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及意義[J].腫瘤基礎與臨床,2011,24(1):1

[17]孫海斌,張虎,丁胭脂,等.Smo siRNA對裸鼠食管癌移植瘤細胞凋亡的影響[J].世界華人消化雜志,2013,21(17):1579

(2013-08-08收稿 責任編輯王 曼)

Influence of Smo siRNA on apoptosis,Smo and bcl-2 genes expression in EC9706 cells

GUOAiye1)，DINGYanzhi2)，ZHANGHu3)，ZHANGHongxin3)，CHENKuisheng3)

1)ClinicalLaboratory,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003 2)DepartmentofPathology，HenanCancerHospital,Zhengzhou450003 3)DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity;HenanKeyLaboratoryofTumorPathology,Zhengzhou450052

Smo;bcl-2;esophageal carcinoma;apoptosis

Aim: To investigate the influence of Smo siRNA on bcl-2 expression and apoptosis of human esophgeal carcinoma EC9706 cells.Methods: Smo siRNA-3 was designed and synthesized successfully,and then transfected into EC9706 cells.The expression of Smo,bcl-2 protein and mRNA of transfected EC9706 cells were detected by Western blot and RT-PCR,respectively,the apoptosis were detected by TUNEL method and flow cytometry,and apoptosis index(AI) and apoptosis cells proportion were calculated.The cells without transfection,transfected with unrelated sequence siRNA or reagent were the control.Results: Compared with the control groups, the mRNA expressions of Smo and bcl-2 in cells transfected with Smo siRNA-3 for 24, 48 and 72 h decreased(P<0.05),especially in cells transfected for 72 h(P<0.05).Compared with the control groups,the protein expressions of Smo and bcl-2 in cells transfected with Smo siRNA-3 for 72 h decreased(F=151.310,143.190，P<0.001),AI increased(F=66.270，P<0.001),and apoptosis cells proportion was higher(P<0.05).Conclusion: Smo siRNA may decrease the expression of bcl-2 through silencing the Smo expression,thus promote the apoptosis of EC9706 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.03.001

*河南省科技創(chuàng)新杰出人才基金資助項目 114200510007

R735.1